Hiperhomocysteinemia wzmaga stan zapalny naczyń i przyspiesza miażdżycę tętnic w modelu mysim ad

Serialne odcinki, o grubości 10 .m, zostały wycięte z poziomu płatków zastawki aortalnej do około 480 .m powyżej płatków w zatoce aortalnej, co drugą sekcję odzyskano i umieszczono na szkiełkach powlekanych żelatyną (5%), i cztery sekcje zostały umieszczone na każdym slajdzie w sumie pięć slajdów. Skrawki wybarwiono oleistą czerwienią O i hematoksyliną / jasnozieloną. Ocenę ilościową obszaru zmian miażdżycowych wykonano na jednym odcinku z każdego slajdu (zaczynając od miejsca, w którym najpierw pojawiają się trzy wyraźne zastawki) przy użyciu mikroskopu Zeiss i obrazu Zeiss (Zeiss, Thornwood, Nowy Jork, USA); przedstawiono średnią powierzchnię zmian ze slajdów od dwóch do pięciu (19). Złożone zmiany miażdżycowe zdefiniowano jako obecność włóknistych zakrętek, rozszczepów cholesterolu lub martwicy zmian (19). Ocena elastolizy. Wykreślono przekroje barwione van Giessen a z zatoki aortalnej i wykonano oznaczenia ilościowe dla zakresu formowania elastolizy / tętniaka (20. 21). Ektazę położeń le ących u podstaw blaszek miażdżycowych oceniano następująco: etap 0, brak elastolizy pomimo zmiany śródbłonka; etap 1, elastoliza wewnętrznej warstwy elastycznej; etap 2, elastoliza wewnętrznej elastycznej warstwy plus jedna lub więcej elastycznych warstw w obrębie podłoża tunicowego; etap 3, elastoliza wewnętrznej warstwy elastycznej, wszystkie elastyczne warstwy w obrębie błony tunicznej, a także zewnętrzna elastyczna blaszka; i etap 4, elastolizę wszystkich warstw elastycznych i wybrzuszenie w przydance. Analiza osocza i czerwonych krwinek. Osocze oceniano pod kątem poziomów glukozy, cholesterolu, triglicerydów i kreatyniny przez Analytics Inc. (Gaithersburg, Maryland, USA). Glikozylowaną hemoglobinę (%) określono na lizatach czerwonych krwinek (Pierce Chemical Co., Arlington Heights, Illinois, USA). Poziomy HC, kwasu foliowego i witamin B12 / B6 przeprowadzono zgodnie z opisem (22). Poziomy TNF-a w osoczu zostały określone przy użyciu testu ELISA z R & D Systems Inc. (Minneapolis, Minnesota, USA). Test przesunięcia elektromobilności. Ekstrakty jądrowe wytworzono zgodnie z opisem (23). Radioznakowaną sondę konsensusową 32P dla NF-kB inkubowano z ekstraktami jądrowymi; powstałe kompleksy poddano elektroforezie metodą PAGE (6%) i przeprowadzono autoradiografię. Immunoblot i zymografia. Podczas składania ofiar odzyskiwano aortę (zatokę aorty do środkowego odcinka piersiowego) i nerkę. Immunoblot przeprowadzono przez poddanie lizatu tkankowego (24) immunoblottingu z receptorem anty (3 dla zaawansowanych produktów końcowych glikacji (anty-RAGE) IgG (24), anty-EN-RAGE IgG (24), anty-VCAM-1 IgG (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA), anty-TF IgG (przygotowane przez Waltera Kisiela i Vijay Rao) i anty-MMP-9 IgG (Oncogene Research Products, Cambridge, Massachusetts, USA). Zymografię przeprowadzono na lizatach aorty przy użyciu żelatynowych żeli (Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Immunohistochemia. Tkanka aorty została odzyskana i utrwalona za pomocą formaliny; zatopione w parafinie skrawki (o grubości 5 urn) zostały przygotowane i poddane immunohistochemii z przeciwciałami anty-TF IgG, anty-Mac 3 IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA), anty-VCAM-1 IgG, anty-RAGE IgG (24) i IgG anty-RAGE (24). Eksperymenty, w których włączono równe ilości nieimmunologicznej IgG, nie wykazały swoistego immunobarwienia (dane nie pokazane). Analizy in vitro. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC) przygotowano i scharakteryzowano jak opisano (24). Komórki w obecności FBS (0,5%) eksponowano na BSA, L-HC lub L-cysteinę (Sigma Chemical Co.), jak wskazano. W niektórych eksperymentach wykonywano testy przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej jak powyżej; w innych przeprowadzono immunoblotting w celu wykrycia antygenów RAGE i TF. Analiza statystyczna. Wszystkie dane są podane jako średnia plus lub minus SD. Gdzie wskazano, przeprowadzono analizę densytometryczną intensywności pasma przy użyciu ImageQuant (Molecular Dynamics, Foster City, Kalifornia, USA). Dane analizowano za pomocą ANOVA i, jak wskazano, poddawano porównaniom post-hoc z zastosowaniem dwustronnego testu t. Wartości P <0,05 uznano za znaczące. Wyniki Aby zbadać zależne od HC działanie naczyniowe in vivo, indukowaliśmy HHcy u myszy z niedoborem apoE, u których rozwija się samorzutnie hipercholesterolemia i miażdżyca (15-16). Myszy karmiono standardową karmą dla gryzoni (dieta A); dieta wzbogacona w metioninę, ale znacznie zubożona w kwas foliowy, witaminy B6 i B12 (dieta B); lub dieta wzbogacona w metioninę i kwas foliowy, B6 i B12 (dieta C). Po 8 tygodniach diety myszy karmione wzbogaconą w metioninę dietą B wykazały około 19-krotny wzrost średniego poziomu HC w osoczu w porównaniu z myszami kontrolnymi otrzymującymi dietę A (47,3. 3,2 vs. [patrz też: szczepionki na pneumokoki, maciej syka, benzoesan sodu szkodliwość ] [więcej w: wypadanie płatka zastawki mitralnej, jacek bryndal, klaudia el dursi ]