Normalna ludzka skóra właściwa zawiera wyraźne populacje komórek dendrytycznych CD11c + BDCA-1 + i makrofagów CD163 + FXIIIA + czesc 4

Podobnie, CD163, który wykazał 100% koekspresji z FXIIIA in situ, okazał się znacznie lepszym markerem FACS. Przeciwciała FXIIIA wiążą się niespecyficznie z komórkami skóry w zawiesinie, być może w wyniku przylegania fragmentów płytek krwi bogatych w FXIIIA, który ulega zwiększeniu podczas hodowli komórkowej (5, 6). Podwójnie znakowana immunofluorescencja BDCA-1 i CD163 potwierdziła, że są one odrębnymi populacjami in situ (Figura 7A), co potwierdza ich zastosowanie jako alternatywnych markerów odpowiednio dla CD11c i FXIIIA w badaniach FACS. Masowe dermalowe zawiesiny pojedynczych komórek wykazywały odrębne populacje BDCA-1 + i CD163hi według FACS (Figura 7B). Komórki bramkowane BDCA-1 + miały wyższy MFI dla CD11c niż populacja CD163hi (Figura 7C), najprawdopodobniej ze względu na zwiększoną czułość FACS w porównaniu z immunohistochemią. Komórki CD163hi miały wyższy MFI dla FXIIIA niż komórki BDCA-1 + (Figura 7C). Komórki bramkowane BDCA-1 + miały również wyższy MFI dla HLA-DR i CD45 niż komórki bramkowane CD163hi (Figura 7C). Podzbiór komórek BDCA-1 + był dodatni dla markerów dojrzewania DC CD86, CD83 i DC-LAMP / CD208 (Figura 7D). Ponieważ komórki B mogą także eksprymować BDCA-1, potwierdziliśmy, że żadna z komórek BDCA-1 + nie była CD19 + według FACS (dane nie przedstawione). Zatem komórki skórne mają wzór ekspresji podobny do charakterystyki in situ. Figura 7BDCA-1 i CD163 są alternatywnymi markerami odpowiednio dla CD11c i FXIIIA. (A) BDCA-1 i CD163 zidentyfikowali odrębne populacje komórek skóry. (B) Komórki BDCA-1 + (czerwone kółko) i komórki CD163 + (niebieskie kółko) również były osobnymi populacjami w skórnych zawiesinach pojedynczych komórek. (C) Histogramy FACS bramkowane na komórkach BDCA-1 + (czerwona linia), komórkach CD163 + (niebieska linia) lub izotypie (zielona linia). Komórki BDCA-1 + to CD11chi, FXIIIAlo, HLA-DRhi i CD45hi. Komórki CD163 + były CD11cmid, FXIIIAhi, HLA-DRmid i CD45lo. (D) Podzbiór komórek BDCA-1 + to CD86hi, CD83 + i DC-LAMPhi. Reprezentatywne wykresy z 3 eksperymentów. Pasek skali: 100 .m. Komórki BDCA-1 + są główną populacją immunostymulującą z normalnej ludzkiej skóry. Aby przetestować właściwości immunostymulujące leukocytów skórnych, skoncentrowaliśmy się na sortowanych przez FACS populacjach komórek BDCA-1 + i CD163hi uwalnianych ze skóry właściwej za pomocą kolagenazy. Dane zestawiono w Tabeli dodatkowej 3, a Figura 8 pokazuje reprezentatywne wykresy FACS w MLR. Posortowane komórki były czyste w 99% w porównaniu z izotypem (Figura 8A). W MLR indukowanych przez dojrzałe DC pochodzące z monocytów in vitro, 63% przeżywających komórek T zostało poddanych rozległej proliferacji w stosunku stymulatora / odpowiedzi 1: 100 w dniu 8 po sortowaniu (Figura 8B). W równoległych hodowlach stymulowanych przez komórki BDCA-1 + 9,1% komórek T uległo proliferacji (stosunek 1:10), w porównaniu z 2,1% komórek CD163 + i 1,0% proliferacji komórek T w tle (Figura 8C). Gdy posortowane populacje BDCA-1 + i CD163 + hodowano przez 2 dni w koktajlu cytokiny poddającym się dojrzewaniu DC przed ustanowieniem MLR, zdolność immunostymulującą komórek BDCA-1 + zwiększono do 25,2% (stosunek 1: 100), ale pojemność komórek CD163 + była niezmieniona (2,2%, stosunek 1: 250, niski ze względu na niskie przeżycie komórek podczas okresu hodowli; Figura 8D). Komórki z sortowanym BDCA-1 + hodowano przez 2 dni bez cytokin, a supernatant z tych komórek po hodowli również zwiększał proliferację limfocytów T (dane nie pokazane). Figura 8BCDCA-1 + są bardziej immunostymulujące. (A) Post-sortuj wykres punktowy komórek skórnych od skóry normalnej do populacji BDCA-1 + i CD163 + (odpowiednio czerwone, lewe i prawe panele) w porównaniu z izotypem (niebieski). (B) Kontrola pozytywna (dojrzały DC pochodzący z monocytów) dla MLR w dniu 8 po sortowaniu przy stosunku stymulatora 1: 100 / odpowiedź. Brama zawiera proliferujące komórki T CD3 + z przesuniętym w lewo CFSE. (C) Posortowane komórki BDCA-1 + jako stymulatory (stosunek 1:10) proliferowały 9,1% komórek T; stosując komórki CD163 + (stosunek 1:10), proliferowano 2,1% żywych komórek T. Tło proliferacji samych komórek T bez stymulacji wynosiło 1,0%. (D) Po posortowaniu komórek i hodowli przez 2 dni cytokinami w celu indukowania dojrzewania, zaobserwowano wyraźny wzrost zdolności stymulacyjnej limfocytów T komórek BDCA-1 + (25,2%, stosunek 1: 100) w stosunku do CD163 (2,2%). Stosunek 1: 250). Reprezentatywne wykresy z 3 eksperymentów. Komórki CD163 + fagocytują duże cząsteczki w tatuażu i mają cechy strukturalne makrofagów. Ultracienkie fragmenty zielonego tatuażu barwiącego wycięto z normalnej skóry z tatuażami. Te sekcje potwierdziły, że barwnik był śródtoplazmatyczny i znajduje się głównie w komórkach skupionych wokół naczyń krwionośnych (Figura 9A)
[więcej w: maciej zagłoba zygler, jacek rybacki, gregor laubsch ]
[patrz też: gregor laubsch, artur szudrowicz, joanna derybowska ]