Receptor 1 hormonu koncentrującego melaninę, nowy cel odpowiedzi autoprzeciwciał w bielactwie ad 5

Produkty amplifikacji PCR zostały oczyszczone i zsekwencjonowane w celu ułatwienia identyfikacji cDNA poprzez przeszukiwanie BLAST w międzynarodowych bazach danych. MCHR1 był kodowany przez jeden z cDNA odzyskanych w procesie biopanningu. CDNA MCHR1 następnie sklonowano do pcDNA3. Translacja in vitro i immunoreaktywność MCHR1. Plazmid pcMCHR1 został przetłumaczony in vitro. Jakość znakowanego radioaktywnie receptora in vitro. Oceniano za pomocą SDS-PAGE i autoradiografii. To ujawniło produkt białkowy o szacowanej masie cząsteczkowej 45 kDa (Figura 1), wielkości, która jest w ścisłym związku z masą cząsteczkową 39 kDa przewidzianą z sekwencji aminokwasowej białka (26). Po dodaniu psich mikrosomalnych błon trzustkowych do reakcji translacji in vitro, widoczne było pasmo białka o zwiększonej masie cząsteczkowej 50 kDa (Figura 1). Zakładamy, że jest to glikozylowany MCHR1. Immunoreaktywność znakowanego radiologicznie MCHR1 transformowanego in vitro. Analizowano w testach radiobindowania za pomocą króliczych poliklonalnych surowic odpornościowych. Średnie indeksy Ab i SD dla MCHR11-S, P PEP7, PEP8 i AZN-LAM wynosiły 9,16. 4,01, 0,97. 0,05, 1,33. 0,42 i 0,86. 0,34, odpowiednio, tym samym wykazując immunoreaktywność znakowanego MCHR1 do antyserum specyficznego dla receptora. Figura 1SDS-PAGE i autoradiografia in vitro. Translokowanego MCHR1. MCHR1 wytworzono in vitro w układzie Lizat retikulocytów sprzężonym z TnT T7. Aby umożliwić glikozylację MCHR1, do reakcji transkrypcji-translacji dodano psie mikrosomalne błony trzustki. W tłumaczeniu in vitro. MCHR1 (linia 1); W teście in vitro p Tłumaczenie i. Glikozylowany MCHR1 (linia 2). Testy radiobindingowe. Surowice od 55 pacjentów z bielactwem, 28 osób zdrowych kontrolnych, 15 pacjentów z SLE, 16 pacjentów z AD i 20 pacjentów z GD przebadano pod względem immunoreaktywności wobec MCHR1 w testach na promieniowanie. Dla każdej surowicy przypisano indeks Ab, który jest średnim wskaźnikiem Ab co najmniej dwóch eksperymentów (Figura 2). Średnie indeksy Ab plus lub minus SD dla grupy kontrolnej, GD, AD, SLE i bielactwa były: 0,95. 0,16, 0,88. 0,19, 0,92. 0,26, 1,13. 0,11 i 1,07. 0,62. Górny poziom normy dla testu radiobinding (średni wskaźnik Ab plus 3 SD dla 28 zdrowych kontroli) oszacowano jako wskaźnik Ab wynoszący 1,43 (Figura 2). Każda surowica z indeksem Ab powyżej tego poziomu była uważana za pozytywną dla MCHR1 Ab. Na tej podstawie żadna z osób zdrowych nie była pozytywna w odniesieniu do Ab. MCHR1. Surowice od 20 pacjentów z GD, 16 z AD i 15 ze SLE były wszystkie ujemne dla Abs do receptora. Spośród badanych pacjentów z bielakiem nabytym, 9 z 55 (16,4%) było uważanych za dodatnie pod względem mysich MCHR1, a częstość występowania Ab receptorów w grupie pacjentów z bielactwem była istotnie większa niż w normie (p = 0,025). Zastosowanie glikozylowanego MCHR1 w badaniu radiobiałania nie zmieniło wskaźnika Ab jakiejkolwiek testowanej surowicy bielactwa lub zdrowej surowicy kontrolnej. Wykorzystano SDS-PAGE do sprawdzenia, czy radioaktywność immunoprecypitowana przez każdą z surowic z dodatnim wynikiem dla MCHR1 Ab w testach radiobindingu była spowodowana receptorem znakowanym [35S]. Figura 3 wskazuje, że surowice surowicowe z dodatnim mianem immunoprecypitowały prążek białka o prawidłowej wielkości w porównaniu z translokowanym MCHR1 in vitro. W doświadczeniach z rozcieńczaniem trzy surowice barwiące pozornie MCHR1 Ab wykazywały nasycone wiązanie aż do rozcieńczenia 1:50 (danych nie pokazano). Figura 2 Testy przeciwobjawowe. Surowice bielactwa (n = 55), surowice pacjenta GD (n = 20) Surowice pacjenta AD (n = 16), zdrowe surowice kontrolne (n = 28) i surowice pacjenta SLE (n = 15) analizowano w testach radiobindowania. Indeks Ab dla każdej surowicy jest średnią z co najmniej dwóch eksperymentów. Szara linia pokazuje górny poziom normy dla testu radiobindingu przy wskaźniku Ab 1,43. Figura 3SDS-PAGE i autoradiografia MCRR1 immunoprecypitowanych albo bielem dodatnim MCHR1 lub zdrowym surowicą kontrolną. MCHR1 wytworzono in vitro w układzie Lizat retikulocytów sprzężonym z TnT T7, a następnie stosowano w testach radiobindowania z bielakiem lub zdrową surowicą kontrolną. W tłumaczeniu in vitro. MCHR1 (linia 1); MCRR1 poddano immunoprecypitacji z surowicami bielactwa dodatnimi od MCHR1 (ścieżki 2. 4); MCRR1 immunoprecypitowano zdrowymi surowicami kontrolnymi (ścieżki 5. 7). Eksperymenty absorpcyjne. Przeprowadzono doświadczenia absorpcji w celu oceny swoistości wiązania Ab z MCHR1 w surowicach pobranych z dodatniego bielactwa (n = 3). Jako kontrolę zastosowano pulę surowic pobranych od osób zdrowych (n = 6). Po wstępnej absorpcji błon komórkowych CHO-MCHR1, indeksy Ab (Figura 4) dla surowic bielactwa były istotnie różne w porównaniu z indeksami Ab dla surowicy bielactwa bez wstępnej absorpcji (P = 0,002) i surowic bielactwa z preinkubacją z błonami komórek CHO. (P = 0,001)
[przypisy: jacek rybacki, benzoesan sodu szkodliwość, młody jęczmień w proszku ]
[hasła pokrewne: trojanek, jacek rybacki, gregor laubsch ]