Receptor 1 hormonu koncentrującego melaninę, nowy cel odpowiedzi autoprzeciwciał w bielactwie czesc 4

Górny poziom normy dla testu obliczono stosując średni wskaźnik Ab plus 3 SD dla populacji 28 zdrowych osób. Każda surowica ze wskaźnikiem Ab powyżej górnego poziomu normy została oznaczona jako pozytywna dla reaktywności Ab. Częstotliwość AB Abs MCHR1 została porównana pomiędzy grupami pacjentów i kontrolami przy użyciu dokładnego testu Fishera dla tabel kontyngencji 2 × 2. Wartości P mniejsze niż 0,05 (dwustronne) uznano za istotne. W celu analizy immunoprecypitowanych białek metodą SDS-PAGE i autoradiografii, kompleksy białkowe G. Sepharose Ab ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 50. L buforu do próbek SDS (23), gotowano, a supernatant odzyskano do elektroforezy w 12% żelu poliakrylamidowym, który został przetwarzane jak wyszczególniono powyżej. Do eksperymentów z rozcieńczaniem, w badaniu radiobiałym użyto surowic pacjentów cierpiących na bielactwo pacjentów z przeciwciałami MCHR1 w końcowych rozcieńczeniach 1:20, 1:50, 1: 100, 1: 200, 1: 500; 1: 1000 i 1: 2000. Eksperymenty absorpcyjne. Linię komórkową jajnika chomika chińskiego (CHO) trwale eksprymującą MCHR1 opisano uprzednio (25). Błony komórkowe przygotowano jak opisano w innym miejscu (25). Pacjentki z bielakiem nabytym dodatnie pod względem przeciwciał MCHR1 Abs i pulę zdrowych kontroli inkubowano w 4 ° C przez 12 godzin z błonami komórkowymi CHO lub CHO-MCHR1, które miały ostateczne stężenie 5 mg / ml surowicy. Po wstępnej inkubacji, surowice zastosowano w oznaczeniu radiobi- zującym z receptorem znakowanym [35S] jak opisano powyżej. Surowice bez uprzedniej absorpcji badano jednocześnie. Wskaźniki Ab obliczono dla każdej badanej surowicy w następujący sposób: liczba zliczeń na minutę immunoprecypitowana przez badaną surowicę podzielona przez zliczenia na minutę immunoprecypitowane przez pulę zdrowych surowic kontrolnych bez wstępnej inkubacji z błonami komórkowymi. Próbki testowano w dwóch eksperymentach i obliczano średni indeks Ab. Różnice we wskaźnikach Ab po preinkubacji z błonami komórkowymi analizowano za pomocą testu Student, a wartości P mniejsze niż 0,05 (dwustronne) uznano za znaczące. Testy wiązania MCHR1. Testy wiązania MCHR1 przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (25). Pokrótce, membrany (10 .g) z komórek CHO eksprymujących MCHR1 inkubowano ze 100 .g kuleczek SPA aglutyniny z kiełków pszenicy (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, Illinois, USA) i 125 .M [125I] y hormonu koncentrującego melaninę ( MCH) (NEN Life Science Products Inc., Boston, Massachusetts, USA) w końcowej objętości 200 ul buforu wiążącego (25 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 5 mM MnCl2, 0,1% BSA) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Niespecyficzne wiązanie określono przez dodanie mM nieznakowanego MCH w inkubacji wiązania. Związany [125I] -MCH wykrywano stosując licznik scyntylacyjny do mikropłytek TOPCOUNT (Packard Instrument Co., Downers Grove, Illinois, USA). Inhibitowanie wiązania [125I] -MCH analizowano przez preinkubację błon komórkowych IgG, przygotowanych zarówno przez zdrowe osoby, jak i pacjentów z bielactwem dodatnim dla MCHR1-Ab w końcowym stężeniu 2 mg / ml. Procentowe hamowanie wiązania MCH obliczono dla każdej próbki IgG badanej jako 100: (cpm wiązało się po inkubacji błon CHO-MCHR1 z próbką IgG / cpm związaną bez inkubacji membran CHO-MCHR1 x 100). Różnice w procentach hamowania wiązania MCH po inkubacji błon komórkowych CHO-MCHR1 z bielactwem i kontrolnymi próbkami IgG analizowano za pomocą testu ucznia. Wartości P mniejsze niż 0,05 (dwustronne) uznano za istotne. Wyniki Konstrukcja biblioteki fagowej cDNA melanocytów. Pierwotny rozmiar biblioteki cDNA melanocytu pJuFo wynosił 106 niezależnych klonów. Po amplifikacji z fagiem pomocniczym wytworzono wyjściową bibliotekę z ekspozycją na faga o mianie 1011 CFU / ml. W celu określenia częstotliwości rekombinowanego fagemidu w bibliotece fagowej, hodowano 40 CFU i wyizolowano fagemid pJuFo z każdej hodowli. Analiza fagemidów przez amplifikację PCR ze starterami 1192 i 1500 wskazała, że biblioteka prezentacji fagowych zawierała rekombinowane fagemidy pJuFo z przybliżoną częstotliwością 90%. Sklonowane fragmenty miały długość od 800 do 2500 pz. Ta biblioteka prezentacji na fagach została wykorzystana do selektywnego wzbogacania białek wiążących IgG od pacjentów z bielactwem. Wzbogacenie fagów prezentujących peptydy wiążące IgG. Bibliotekę prezentacji fagowej melanocytu cDNA poddano trzem rundom biopanningu przeciwko puli biotynylowanej IgG od dziesięciu pacjentów z bielactwem, którzy nie mieli żadnej innej choroby autoimmunologicznej. Po trzeciej rundzie wzbogacania hodowano 30 CFU. Fagemid DNA wyizolowano z każdej hodowli i analizowano przez amplifikację PCR z 1192 i 1500 starterami
[patrz też: brwi makijaż permanentny, benzoesan sodu szkodliwość, termometr microlife instrukcja obsługi ]
[podobne: termometr microlife instrukcja obsługi, młody jęczmień w proszku, śliwka w czekoladzie kalorie ]