Ścieżka MEKK1-JNK odgrywa rolę ochronną w przeciążeniu ciśnieniowym, ale nie pośredniczy w przeroście mięśnia sercowego cd

Ograniczenie liczenia całych jąder i jąder TUNEL-dodatnich do obszarów o rzeczywistym przekroju miocytów umożliwiło selektywne zliczenie tylko tych jąder, które wyraźnie znajdowały się w miocytach (25). W przypadku niektórych próbek przeprowadzono trzykrotne barwienie jodkiem propidyny (Vector Laboratories Inc.), TUNEL i przeciwciałem anty-aktynowotworowym (Sigma-Aldrich), a następnie przeprowadzono analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu zweryfikowania wyników uzyskanych przy użyciu światła mikroskopia. Komórki TUNEL-dodatnie również policzono w zmianach zapalnych. W tym przypadku obszar zapalny został po raz pierwszy zidentyfikowany jak opisano powyżej, a serie przekrojów zostały poddane barwieniu TUNEL. Analizy Northern blot i RT-PCR. Całkowity RNA wyizolowano z części wierzchołkowej LV za pomocą Trizol (Life Technologies Inc., Carlsbad, California, USA). Analizy Northern blot przeprowadzono zgodnie z opisem (26). Genomowy DNA usunięto przez inkubację z DNazą wolną od RNazy. Opisano metodę RT-PCR (27). Jeden mikrogram całkowitej próbki RNA poddano odwrotnemu transkrypcji w x buforze do PCR (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) w obecności 5 mM MgCl2, mM dNTP, U / lot inhibitora RNazy, 2,5 | M losowego primery heksanukleotydowe i odwrotna transkryptaza wirusa Mysiej białaczki 2,5 U / yl. Reakcję RT przeprowadzono w 42 ° C przez 60 minut, a następnie denaturację w 99 ° C przez 5 minut i chłodzenie w 5 ° C przez 5 minut. PCR przeprowadzono w x buforze do PCR zawierającym 2 mM MgCl2, 2,5 jednostki polimerazy DNA Taq i 0,15. M odpowiednich primerów (Tabela 1). Profil amplifikacji PCR dla każdego z badanych genów obejmował etap wstępnej denaturacji w 95 ° C przez 30 sekund do minuty. Etap wyżarzania starterów był następujący: TGF-a, 63 ° C przez 60 sekund; TNF-a, 62 ° C przez 30 sekund; i GAPDH, 58 ° C przez 45 sekund. Produkty PCR przedłużano przez 45 sekund w 72 ° C, z końcowym etapem elongacji w 72 ° C przez 7 minut. Liczby cykli PCR były następujące: TGF-a, 30; TNF-a, 30; i GAPDH, 20. We wszystkich przypadkach, PCR próbek RNA była ujemna przy braku RT (dane nie pokazane). Oceny ilościowej ekspresji genów dokonano za pomocą analizy densytometrycznej barwienia bromkiem etydyny produktów PCR. Przy stałych numerach cyklu PCR, zmienne wejściowe stężenia RNA od 0,1 do 2,5 | jg dały liniową amplifikację dla każdego genu (nie pokazano). Tabela Primery stosowane do analizy RT-PCR Statystyki. Wszystkie dane są podane jako średnie. SEM. Analizy statystyczne między grupami wykonano w jednokierunkowej analizie wariancji ANOVA, a gdy wartości F były znaczące przy granicy ufności 95%, różnice między średnimi grup oceniano stosując rzutowaną przez Fisher a najmniej istotną różnicę po teście dla danych grupowych z P <0,05. uważane za znaczące. Wyniki Aktywacja JNK przez przeciążenie ciśnieniowe jest zniesiona w MEKK1. /. myszy. Aby zbadać, czy MEKK1 krytycznie pośredniczy w aktywacji JNK przez przeciążenie ciśnieniowe w sercu myszy, oceniliśmy aktywności JNK w MEKK1 + / + (kontrola) i MEKK1. /. myszy serca poddane operacji pozorowanej lub opaski aortalnej przez 1, 7 i 14 dni. Analizy immunoblot z przeciwciałem anty-fosfo-JNK wykazały 2,9-, 3,5- i 2,6-krotny wzrost fosfo-p46-JNK w odpowiedzi na przeciążenie ciśnieniowe odpowiednio przez 1, 7 i 14 dni, w porównaniu z operacją pozorowaną u myszy kontrolnych. (Rysunek 1, aib). Co ciekawe, przeciążenie ciśnieniem przez 1, 7 lub 14 dni nie zwiększyło aktywności kinazy p46-JNK w MEKK1. /. myszy w porównaniu do osób poddanych fikcji (ryc. 1, aib). Dłuższe ekspozycje immunoblotu pokazały, że nie było znaczących zmian w aktywności p54-JNK po pasmowaniu w porównaniu z operacją pozorowaną w kontroli lub MEKK1 (3 /. myszy (nie pokazano). Analizy immunoblotowe dwóch powtórzeń z przeciwciałem anty-JNK1 wykazały, że porównywalne ilości próbek zostały określone ilościowo w tych doświadczeniach. Testy kinazy immunoenzymetrycznej wykorzystujące przeciwciało anty-JNK1 potwierdziły, że aktywność na JNK1 była istotnie zwiększona przez pasowanie aorty przez 7 dni u myszy kontrolnych, ale nie w MEKK1 (3). myszy, w porównaniu z operacją pozorowaną w każdej grupie (dane nie pokazane). Wyniki te sugerują, że MEKK1 odgrywa istotną rolę w pośredniczeniu aktywacji p46-JNK przez przeciążenie ciśnieniowe u myszy. Figura Unieszkodliwienie JNK przez przeciążenie ciśnieniowe jest zniesione, podczas gdy ERK i p38-MAPK są zachowane, w MEKK1. /. myszy. Pasemka aortalna (B) lub pozorna operacja (S) została przeprowadzona w MEKK1 + / + lub MEKK1. /. myszy. Zwierzęta uśmiercono po 1, 7 lub 14 dniach. (aib) Aktywność kinazy p46-JNK określono przez przeciwciało anty-fosfospecyficzne JNK [przypisy: jacek rybacki, młody jęczmień w proszku, joanna derybowska ] [hasła pokrewne: olej z konopii indyjskiej, ciśnieniomierz elektroniczny, termometr microlife instrukcja obsługi ]