TGF-dependent zależna patogeneza wypadania płatka zastawki mitralnej w mysim modelu zespołu Marfana ad 7

Barwienie następnie amplifikowano za pomocą koziej IgG jako odczynnika blokującego i biotynylowanego przeciwciała anty-streptawidyny (koza), a następnie drugiego etapu barwienia z koniugatem streptawidyna-fikoerytryna. Fluorescencję wykrywano za pomocą skanera GeneArray Affymetrix GS3000, a analizę obrazu każdego GeneChip przeprowadzono za pomocą oprogramowania GeneChip Operating System z Affymetrix (GCOS1.1.1), stosując standardowe ustawienia domyślne. Aby porównać różne układy, wykorzystano globalne skalowanie, które przeskalowało wszystkie zestawy sond do docelowej intensywności zdefiniowanej przez użytkownika (TGT) równej 150. Aby ustalić jakość całkowitego RNA z próbek, użyliśmy Agilent Bioanalyzer Lab na chipie technologii i potwierdził stosunki rRNA i czyste przebiegi próbek. Podobnie, ta technologia jest używana do potwierdzenia jakości RNA w postaci cRNA i fragmentowanego cRNA. Aby ocenić jakość hybrydyzacji, obraz GeneChip i porównanie chipów, potwierdziliśmy następujące parametry: wartości współczynników skalowania w porównywalnym zakresie (od 0,7 do 1,4); niskie wartości tła (od 51 do 65); wysoki odsetek obecnych połączeń (od 47 do 52); zgodny 3.: 5. stosunki GAPDH jako reprezentacji genów porządkowych; oraz obecność lub nieobecność Bio B i C jako wewnętrznych kontroli kłosów. Opisy te obejmują wszystkie informacje aktualnie rozpatrywane w ramach wytycznych dotyczących minimalnej informacji na temat eksperymentu na mikromacierzy (MIAME), z którymi w podstawowych procedurach stosuje się podstawowy ośrodek mikromacierzy Johns Hopkins Medical Institution. Analiza danych mikromacierzy. Próbki mRNA analizowano przy użyciu układu genów Affymetrix MOE430A. Zakładając, że tylko niewielka część genów ulegnie różnej ekspresji między próbkami różnych genotypów, dostosowaliśmy jasność próbek chipów do porównywalnego poziomu, normalizując wartości sygnału sondy komórek (.CEL) w parze sond Affymetrix (idealnie dopasowany [PM]; niezgodny [MM]) poziom danych z metodą. niezmienniczej normalizacji zestawu,. (37), który wybiera podzbiór sond PM z małą różnicą w zakresie różnej pozycji pomiędzy 2 układami w procedurze iteratywnej, aby służyć jako podstawa do dopasowania krzywej normalizacyjnej. Znormalizowane dane .CEL zostały następnie wykorzystane do oszacowania wskaźnika ekspresji opartego na modelu PM / MM (z błędami standardowymi) dla zestawów sond, co doprowadziło do dalszych obliczeń fałdowania zmian i ich 90-procentowych przedziałów ufności (38). Niższą granicę 90% przedziału ufności, ostrożną ocenę krotności zmiany, użyto do początkowej identyfikacji genów o różnej ekspresji, tak, że było 90% pewności, że prawdziwa krotność zmiany ekspresji była większa lub równa 1,5. Różnica co najmniej 50 wielkości natężenia sygnału została ustalona jako dodatkowe kryterium, aby zminimalizować wpływ. Szumu. (lub odmiennie wyrażane) geny. Obliczenia przeprowadzono za pomocą dChip 1.2 i 1.3 (wersja testowa, http://www.dchip.org). Dane dotyczące mikromacierzy są publikowane online (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo, numer dostępu GSE1852). Hybrydyzacja in situ. Sekwencję o długości 305 bp z centralnego regionu kodującego bydlęcego IGI3 przygotowano zgodnie z wcześniejszym opisem (39). Siedemdziesięciodniową ciążę zarodki bydlęce utrwalano w 10% zbuforowanej obojętnej formalinie w objętości 20 razy większej od masy tkanki przez 24-72 godzin w temperaturze pokojowej. Skrawki utrwalonych zarodków pocięto na grubość 5 .m i przeprowadzono hybrydyzację in situ, jak opisano wcześniej (39). Preparaty wybarwiano kontrastowo hematoksyliną-eozyną, a ziarna srebra wizualizowano za pomocą mikroskopii w ciemnym polu. Podziękowania Dziękujemy członkom laboratorium HC Dietz za wsparcie i porady. Praca ta została wsparta przez Howard Hughes Medical Institute (do HC Dietz); NIH udziela AR41135 i AR049698 (do HC Dietz), HL53325 (do RP Mecham) i HL067056 (do DP Judge); Narodowa Fundacja Marfana (do HC Dietza i A. Chenga); Centrum Badania Syndromu Marfana Williama S. Smilowa (do HC Dietz); Dana i Albert. Cubby. Centrum Chorób Aortycznych Brokuła (do Sędziego DP); oraz Stanley J. Sarnoff Endowment for Cardiovascular Science, Inc. (do CM Ng). Przypisy Niestandardowe skróty: AV, przedsionkowo-komorowe; BMP, białko morfogenetyczne kości; EDN1, endotelina-1; FLNA, filamin a; y-h3, gen indukowalny przez TGF-y H3; LAP, peptyd związany z opóźnieniem; LTBP, utajone białko wiążące TGF-a; MFS, zespół Marfana; MM, niedopasowanie; MVP, wypadnięcie płatka zastawki mitralnej; PM, idealny mecz; P-Smad2, fosforylowana postać Smad2; TIMP1, inhibitor tkankowy metaloproteinazy. 1. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali, że nie ma konfliktu interesów.
[hasła pokrewne: brwi makijaż permanentny, jacek rybacki, olej z konopii indyjskiej ]
[podobne: jacek rybacki, gregor laubsch, artur szudrowicz ]