Toksyna VacA Helicobacter pylori jest permeazą mocznika, która promuje dyfuzję mocznika w nabłonku ad 5

Niespolaryzowane komórki AGS inkubowano z 125 nM aktywowanego VacA we wskazanych odstępach czasu, a następnie przemywano i testowano pod kątem uwalniania mocznika [14C]. Strzałka wskazuje wymywanie toksyny przed dalszą inkubacją, w równoległych próbkach (pościg). Wkład: komórki AGS były lub nie były inkubowane w warunkach zubożania ATP (patrz Metody) i traktowane przez 3 godziny aktywowanym VacA (otwarte słupki) lub pozostawione bez traktowania (wypełnione słupki). Następnie określono szybkość wypływu mocznika. Średnia z trzech eksperymentów. SE jest zgłaszane. * Porównywane wielkości są statystycznie różne (test ucznia, P <0,05). Contr., Kontrola. Ani podstawowe, ani indukowane VacA strumienie mocznika nie mogą być modyfikowane przez obecność ouabainy (0,25 mM) lub 8Br-cAMP (1 mM) i 8Br-cGMP (1 mM) (danych nie pokazano). Zastąpienie NaCl (150 mM) w pożywce do oznaczania mocznika za pomocą 300 mM mannitolu nie wpłynęło na indukowane VacA strumienie mocznika (dane nie pokazane). Indukowany przez VacA wzrost transepitheli i dyfuzji mocznika przez błonę spowodowany jest poriem VacA. Anionowe kanały i blokery transporterów mocznika zostały wykorzystane do zbadania mechanizmu indukowanej VacA przenikalności mocznika. NPPB, bloker porów VacA (20, 29), hamował wywołany przez toksynę przepływ przeznabłonkowy mocznika w monowarstwie komórek MDCK II do maksymalnego zasięgu około 55% kontroli, z połową maksymalnego stężenia około 50. M ( Figura 5a). Podobnie, NPPB częściowo hamowało permeabilizację błony komórkowej do mocznika indukowanego przez VacA w niespolaryzowanych komórkach AGS (Figura 5b). Flororetin, bloker eukariotycznych transporterów mocznika (30), skutecznie hamował wzrost zarówno przeznabłonkowej i transmembranowej dyfuzji mocznika indukowanej przez VacA (Figura 5, aib). Przezbłonowy strumień mocznika izolowanych oocytów z Xenopus laevis, samoistnie pozbawiony swoistego transportu mocznika (31), również został zwiększony (35. 4%, n = 3) przez VacA (700 nM przez 4 godziny w 24 ° C), a to efekt był wrażliwy na floretynę (dane nie pokazane). Rycina 5 Wpływ NPPB i floretyny (Phlor.) Na wzrost przeznabłonkowego i transmembranowego strumienia mocznika z powodu VacA. (a) Spolaryzowane monowarstwy MDCK II potraktowano 125 nM aktywowanym VacA przez 3 godziny, a następnie przemyto i poddano dalszej analizie przepływowi mocznika [14C] mocznika w obecności wskazanych stężeń NPPB lub floretryny (dodanych do przedziału wierzchołkowego i boczno-bocznego) . (b) Niespolaryzowane komórki AGS były odurzone przez 125 nM VacA w 37 ° C przez 3 godziny i badano pod kątem początkowej szybkości napływu komórek mocznika [14C] i wypływu, w obecności 250 .M floretyny lub NPPB. Dane wyrażono jako procent wzrostu obserwowanego w kontrolach (+ VacA, brak inhibitora). Dane są średnią z trzech eksperymentów przeprowadzonych w dwóch egzemplarzach. SE. Flororetin hamował wakuolację komórek niespolaryzowanych traktowanych VacA w obecności jonów amonowych (Figura 6a). PH kwaśnych przedziałów w nietraktowanych komórkach nie zostało zmienione przez floretynę, jak oceniano na podstawie poboru podstawowego obojętnej czerwieni (dane nie pokazane). Związek ten zapobiegał indukowanemu przez VacA wzrostowi przewodnictwa jonowego monowarstw komórek MDCK I (Figura 6b). W tym układzie nabłonkowym strumień mocznika był również hamowany przez floretynę, o charakterystyce zależnej od protokołu zatrucia (Figura 6c). Jeśli flore- tynę koinkubowano z VacA, a następnie wypłukano lub dodano po zatruciu, podczas oznaczania przepływu przeznabłonkowego mocznika obserwowano częściowe zahamowanie. Z drugiej strony, jeśli był on utrzymywany podczas obu etapów intoksykacji i oznaczania, zaobserwowano silną inhibicję, mniej więcej odpowiadającą sumie efektów wywołanych przez inne protokoły. Jest to zgodne z hamowaniem przez flore tynę zarówno indukowanego VacA szlaku transkomórkowej moczowej dyfuzji, jak i zmiany szlaku okołokomórkowego. Ryc. 6 Wpływ phloretin na wakuolację komórek i wzrost przewodnictwa jonowej warstwy jednowarstwowej indukowanej przez VacA. Niepolaryzowane komórki HeLa, MDCK I i MDCK II traktowano przez 6 godzin 125 nM VacA w DMEM, 2% FCS, plus 5 mM NH4Cl (a) lub samą pożywką. Komórki następnie testowano pod względem poboru neutralnej czerwieni. Dane wyrażono jako procent wzrostu NRU indukowanego przez VacA w nieobecności inhibitorów. Dane pochodzą z trzech eksperymentów przeprowadzonych w dwóch egzemplarzach. SE. (b) Monowarstwy MDCK I traktowano przez 4 godziny 125 nM VacA w DMEM 10% FCS w 37 ° C w obecności różnych stężeń floretyny. Następnie mierzono przewodnictwo jonowe. (c) Zwiększenie przepływu boczno-bocznego mocznika [14C] w mocznicach określono za pomocą spolaryzowanego nabłonka MDCK I traktowanego VacA przez 4 godziny, w obecności lub pod nieobecność 250 .M floretyny podczas oznaczania zatrucia i / lub przepływu mocznika, jak określono [więcej w: pogotowie stomatologiczne kielce, termometr microlife instrukcja obsługi, szczepionki na pneumokoki ] [więcej w: benzoesan sodu szkodliwość, paznokcie w dwóch kolorach, osłabienie organizmu przyczyny ]