Toksyna VacA Helicobacter pylori jest permeazą mocznika, która promuje dyfuzję mocznika w nabłonku ad

Syntetyczna difostanoilo-fosfatydylocholina (czystość> 99%) pochodziła z lipidów polarnych Avanti (Alabaster, Alabama, USA). Roztwory mocznika wytworzono świeżo przed eksperymentami. Hodowlę komórkową. Komórki hodowano na plastiku w temperaturze 37 ° C w wilgotnej atmosferze 5% (obj./obj.) CO2 w DMEM zawierającej 10% (obj./obj.) FCS i gentamycyny. Komórki oderwane trypsyną-EDTA wysiewano na filtrach poliwęglanowych lub studniach plastykowych o gęstości 0,5 x 106 / cm2 i dalej trzymano w pożywce hodowlanej, jak wskazano powyżej. Różnicowanie nabłonka uzyskano po hodowli na filtrach przez 14 dni, podczas gdy nieróżnicowane komórki hodowano na plastiku przez 2 dni przed eksperymentami. Pomiar przepływów przezgłębnikowych. Monowarstwy na filtrach przemyto świeżą pożywką hodowlaną i traktowano aktywowaną kwasem lub nieaktywowaną VacA (15-125 nM) rozcieńczoną w tej samej pożywce. Kontrole traktowano w ten sam sposób równoważnymi podwielokrotnościami PBS. Po 0,25-27,0 godzin inkubacji, niezwiązaną toksynę przepłukano przez przemycie DMEM bez czerwieni fenolowej, 0,023% BSA (wag./obj.), 10 mM Na-HEPES (pH 7,4), i inkubację kontynuowano w tym samym medium w 37 ° C. ° C, w normalnej atmosferze, po umieszczeniu znakowanych radioaktywnie znaczników (45 . M substancji rozpuszczonych lub 2 .Ci / ml w przypadku [3H] wody) w boczno-bocznej komorze. Po pożądanych przedziałach czasowych, ośrodek wierzchołkowy został odzyskany i zastąpiony wstępnie ogrzanym podłożem. Radioaktywność oznaczono metodą scyntylacji cieczy i przepływów wyrażonych jako pmol / hcm2 monowarstwy komórek. Przewodność jonów zmierzono w 37 ° C za pomocą aparatu Millipore Corp. (Bedford, Massachusetts, USA). W niektórych eksperymentach, niewyznakowany mocznik i / lub tiomocznik (100. 400. M), NPPB, pCMBS lub floretina (50. 500. M) włączono do obu komór szczytowych i boczno-bocznych podczas transepitalnych testów dyfuzyjnych lub podczas intoksykacji VacA, jako określony. Pomiar strumieni transbłonowych. Komórki w plastikowych studzienkach odurzono lub nie za pomocą VacA, jak opisano powyżej. W niektórych przypadkach komórki przemyto dwukrotnie lodowato zimnym PBS (pH 7,4), zawierającym 0,023% (wag./obj.) BSA (PBS-BSA) i dalej inkubowano z radioznakowanymi substancjami rozpuszczonymi (45 | jM) w tym samym medium w 4 ° C. C dla różnych przedziałów czasowych (2,5. 15 minut). Radioaktywność związaną z komórkami określono po trzech płukaniach (czas przemywania, około 20 sekund) za pomocą PBS-BSA (4 ° C) i lizę komórek w PBS-BSA plus 0,5% (wag./obj.) SDS. Alternatywnie, po zatruciu, komórki przemyto pożywką hodowlaną i dalej inkubowano w 37 ° C w tych samych warunkach przez godzinę w obecności znakowanych znaczników (45 | jM). Komórki następnie szybko przemyto i dalej inkubowano w PBS-BSA w 4 ° C. Radioaktywność obecną w środowisku zewnątrzkomórkowym określono w różnych punktach czasowych (2,5. 15 minut). W niektórych eksperymentach komórki AGS i HeLa były pozbawione ATP (24): komórki były poddawane wstępnej obróbce w temperaturze 37 ° C za pomocą mg / ml NaN3 przez 30 minut i przez dodatkowe 30 minut z mg / ml NaN3 i 13 mM 2-deoksy -D-glukoza w DMEM wolnym od glukozy i pirogenu plus 10% (obj./obj.) Dializowanej FCS, a następnie inkubowana z VacA w tych samych warunkach, przed określeniem transmembranowych strumieni mocznika. W innych doświadczeniach kontrolne komórki HeLa z odurzaniem VacA traktowano wstępnie mM 8Br-cAMP lub mM 8Br-cGMP lub 0,250 mM ouabain przez 30 minut, a następnie mierzono strumienie mocznika w obecności tych samych agonistów. Alternatywnie, podczas pomiaru strumienia mocznika, NaCl w pożywce zewnątrzkomórkowej zastąpiono izoosmotycznym mannitolem (25). Oocyty izolowane z jajnika Xenopus laevis traktowano 2 mg / ml kolagenazą A1 w buforze OR-2 przez 2 godziny w 25 ° C, a następnie ręcznie defolli-dowano. Po nocnym wyzdrowieniu w 20 ° C, komórki jajowe traktowano lub nie aktywowanym kwasem VacA w 24 ° C przez 4 godziny, a wychwyt i uwalnianie mocznika 14C określano jak opisano (25) w buforze Barth a (88 mM). NaCl, mM KCl, 0,82 mM MgS04, 0,33 mM Ca (NO3) 2, 0,41 mM CaCl2, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES / Na [pH 7,4], 10 U / ml penicyliny i 10 ug / ml streptomycyny) w 24 ° C. Floretin (200 .M) był w niektórych przypadkach włączony do eksperymentów strumienia mocznika. Komórkowa wakuolizacja. Komórki wysiano w 24-studzienkowych tacach o gęstości 103 / cm2 2 dni przed eksperymentami, a następnie potraktowano 50 nM VacA wstępnie aktywowaną przy pH 2,0 w DMEM zawierającym 5 mM NH4Cl i różne stężenia floretryny (0. 480. M) w 37 ° C. DO. Po 6 godzinach oznaczano wakuolację komórek za pomocą testu poboru czerwieni obojętnej, jak opisano poprzednio (15). Pomiar indukowanego VacA prądu jonowego w planarnych dwuwarstwach lipidowych. Doświadczenia przeprowadzono jak opisano wcześniej (17), z 0,5 M KCl, 0,5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2 i 10 mM HEPES / K (pH 7,2) w obu komorach.
[więcej w: jacek rybacki, joanna derybowska, szczepionki na pneumokoki ]
[patrz też: trojanek, jacek rybacki, gregor laubsch ]