Toksyna VacA Helicobacter pylori jest permeazą mocznika, która promuje dyfuzję mocznika w nabłonku cd

VacA (2. 4 nM) aktywowane przy niskim pH (2,0) dodano do przedziału cis i prąd oznaczono z dodatkiem lub bez dodatku do strony cis lub trans inhibitorów (0. 200. M phloretin; 0. 500 (3M pCMBS; 0-400 mM tio-mocznik i mocznik). Prąd był przenoszony głównie przez Cl, ponieważ VacA jest anionowo selektywny (17). Wyniki VacA zwiększa transepthelialną dyfuzję mocznika. Polaryzowane nabłonki in vitro naśladują wodoszczelne nabłonki obecne w nerce, pęcherzu moczowym i, co najważniejsze w obecnym badaniu, błonę śluzową żołądka (26). Szczelność jest związana z rozwojem zróżnicowanej błony wierzchołkowej, wzbogaconej w cholesterol i sfingolipidy (27, 28). Spolaryzowane monowarstwy MDCK I, MDCK II i CaCo2 zastosowano do zbadania wpływu VacA na transepitalną dyfuzję mocznika i innych małych neutralnych cząsteczek. Ich podstawowa odporność na dyfuzję mocznika została porównana z transepitalną opornością elektryczną, parametrem w dużym stopniu zależnym od szczelności połączeń komórka-komórka (szlak parakomórkowy). Dane pokazują, że przepuszczalność nabłonka do mocznika i do jonów nie koreluje (ryc. 1, aib), silnie sugerując, że bariera nabłonkowa mocznika w naszych układach modelowych jest najczęściej reprezentowana przez błony komórkowe, tj. Szlak przezkomórkowy, zgodnie z innymi badaniami (26, 28). Rycina Wpływ VacA na przepływ przeznabłonkowy mocznika w spolaryzowanych monowarstwach komórek MDCK I, MDCK II i CaCo2. (a) Monowarstwy komórek różnicowano in vitro na porowatych filtrach poliwęglanowych, a ich przewodnictwo jonowe określono w 37 ° C. (b) Po dodaniu 45 | jM mocznika [14C] do przedziału podstawno-bocznego zmierzono przepływ przeznabłonkowy mocznika w 37 ° C, określając ilość znacznika w przedziale wierzchołkowym. (c. e) Monowarstwy komórek inkubowano apikalnie z 125 nM wstępnie aktywowaną (pH 2,0) VacA (wypełnione kółka), nieaktywowaną VacA (puste kółka) lub bez toksyny (wypełnione kwadraty) w DMEM, 10% FCS. Przeznabłonkową dyfuzję mocznika [14C] do przedziału wierzchołkowego określano po różnych przedziałach czasowych, zaczynając od 3 godzin. Wartości są średnią z trzech eksperymentów. SE. Po zatruciu przez 3 godziny aktywowanym VacA o niskiej wartości pH (125 nM), dodanym do przedziału wierzchołkowego w celu naśladowania warunków in vivo, zwiększono dyfuzję mocznika we wszystkich testowanych nabłonkach (Figura 1, c, d, i e). Najsilniejszy efekt (20-krotny przyrost w stosunku do nabłonka kontrolnego) rejestrowano za pomocą monowarstw MDCK I, podczas gdy w przypadku komórek MDCK II i CaCo2 efekt był mniej wyraźny (odpowiednio około dwa i trzy razy wartość kontrolna), ale nadal znaczący . W wartościach bezwzględnych efekt VacA z tymi dwiema ostatnimi liniami komórkowymi wynosił 20. 24% obserwowanego dla komórek MDCK I. Nieaktywowany VacA był znacznie mniej skuteczny we wszystkich przypadkach. Analizę odpowiedzi na działanie efektu VacA na przepływ przeznabłonkowy mocznika i na przewodnictwo nabłonka jonowego przeprowadzono za pomocą nabłonka MDCK I i MDCK II po 3-godzinnym zatruciu (Figura 2, aib). W pierwszym przypadku efekt VacA osiągnął maksymalną wartość około 130 nM, a połowę maksymalnego wzrostu uzyskano przy około 40 nM. W tym ostatnim osiągnięto plateau przy około 60 nM, a pół-maksymalne stężenie wynosiło około 20 nM. Przewodnictwo jonowe nabłonka monowarstw MDCK I zwiększyło się czterokrotnie z 125 nM VacA, zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami (21, 22). Jednak przy niższych dawkach VacA (<16 nM) wzrost przewodnictwa jonowego był znikomy, podczas gdy strumień mocznika był już czterokrotnie wyższy niż w kontroli. W zgodzie z naszymi poprzednimi danymi (21), VacA nie zmienił TER CaCo2 (danych nie pokazano) i monowarstw MDCK II. Dane te sugerują, że VacA zwiększa transepthelialną dyfuzję mocznika przez aktywację szlaku przezkomórkowego, chociaż prawdopodobnie udział szlaku parakomórkowego prawdopodobnie występuje z komórkami MDCK I przy wysokich dawkach VacA (patrz poniżej). Rycina 2Dozowa reakcja, kinetyka i nienasycalność indukowanego przez VacA mocznikowego strumienia przeznabłonkowego. Monowarstwy komórek MDCK I (a) i MDCK II (b) potraktowano apikalnie wskazanymi stężeniami aktywowanej VacA w DMEM, 10% FCS przez 3 godziny w 37 ° C. Określono dyfuzję mocznika w moczu (puste kółka) i przewodnictwo jonowe (wypełnione kółka). Wartości są średnią z czterech eksperymentów w duplikacie. SE. (c) Po wskazanych czasach intoksykacji za pomocą aktywowanej (otwarte kółka) lub nieaktywowanej (wypełnione kółka) VacA (125 nM), określono transepthelialny strumień mocznika przez spolaryzowane monowarstwy komórek MDCK II. Średnie z dwóch eksperymentów prowadzonych w dwóch egzemplarzach są zgłaszane ze średnimi odchyleniami [patrz też: trojanek, benzoesan sodu szkodliwość, pogotowie stomatologiczne kielce ] [hasła pokrewne: artur szudrowicz, joanna derybowska, maciej zagłoba zygler ]