Toksyna VacA Helicobacter pylori jest permeazą mocznika, która promuje dyfuzję mocznika w nabłonku czesc 4

Mierzono następnie poziom radioaktywności w komorze szczytowej, uzyskując wykresy analogiczne do tych na Fig. 1, na których nachylenie zostało naniesione. Linia przerywana reprezentuje teoretyczną korelację liniową. Dyfuzja mocznika przez nabłonek MDCK II wzrosła natychmiast po dodaniu VacA i osiągnęła maksimum (trzykrotny wzrost) po około 7. 8 godzinach. Przepływ mocznika pozostawał wysoki przez następne około 15 godzin (rysunek 2c). Nieaktywowany VacA miał niższy efekt nawet po długim czasie inkubacji. Aby sprawdzić, czy układ transportu mocznika indukowany przez VacA był nasycalny, przepływ mocznika [14C] mierzono monowarstwami MDCK II w obecności wzrastających stężeń niewyznakowanego mocznika (Figura 2d). Dyfuzja mocznika wzrosła prawie liniowo do 400 mM, zgodnie z pasywnym transportem nienasyconej mocznika. Tabela porównuje wpływ VacA na transepitalny przepływ mocznika i innych małych neutralnych cząsteczek przez monowarstwy MDCK II. Dyfuzja tiomocznika została skutecznie zwiększona przez VacA, podczas gdy wpływ na glicerynę i mannitol był niewielki. Zgodnie z oczekiwaniem (21) dyfuzja mannitolu była zwiększona w monowarstwach MDCK I, ale przy znacznie mniejszej skuteczności (. 6% przepływu mocznika) (danych nie przedstawiono). Przepływ przeznabłonkowy 3H-H2O nie został zmodyfikowany (dane nie pokazane). Tabela Wpływ VacA na szybkość dyfuzji (pmol / hcm2) różnych cząsteczek przez monowarstwy MDCK II VacA zwiększa przepuszczalność błony komórkowej do mocznika. Dane opisane powyżej sugerują zwiększony przez VacA wzrost przenikalności błony komórkowej do mocznika. Rzeczywiście, VacA zwiększył szybkość penetracji mocznika do niespolaryzowanych ludzkich komórek żołądkowych (AGS), jak również jego wypływu po wcześniejszym wyrównaniu (Figura 3, aib). Przepuszczalność mocznika z błony komórkowej niespolaryzowanych komórek MDCK I, MDCK II, HeLa i MKN28 również została zwiększona przez traktowanie VacA (Figura 3, c i d). Reakcja na dawkę przeprowadzona z komórkami AGS, po 3 godzinach zatrucia (Figura 4a), wykazała, że indukowana przez VacA permeabilizacja błony plazmatycznej osiągnęła plateau przy w przybliżeniu 125 nM, z połowicznym maksymalnym efektem przy około 30 nM. Podobne dane uzyskano dla niepolaryzowanego MDCK II (dane nie pokazane). Podobnie jak w przypadku nabłonka spolaryzowanego, VacA zwiększył również transmembranową dyfuzję tiomocznika, ale nie glicerolu (ryc. 4a, wkładka). Wpływ VacA na niespolaryzowane komórki AGS (Figura 4b) był już silny po 15 minutach i prawie maksymalny po godzinie. W ciągu następnych 7 godzin strumień transmembranowy mocznika pozostał stały i nie został odwrócony przez wymywanie toksyny (pościg). Podobny przebieg permeabilizacji w czasie stwierdzono, gdy wychwyt mocznika przez komórki był monitorowany (dane nie pokazane). Wpływ VacA na AGS (Figura 4b, wstawka) i komórki HeLa (dane nie pokazane) nie był hamowany przez blok endocytozy, po wyczerpaniu ATP (24). Figura 3 Wpływ VacA na przepuszczalność błony komórkowej do mocznika w różnych niespolaryzowanych typach komórek. (aib) W przedstawionych reprezentatywnych doświadczeniach (n = 10) komórki AGS hodowano na plastiku przez 2 dni i traktowano (wypełnione kółka) lub nie (wypełnione kwadraty) przez 3 godziny aktywowanym VacA (125 nM) w 37 ° C. C w DMEM, 10% FCS, przemyto PBS-BSA w 4 ° C i dalej inkubowano w tym samym medium. Napływ mocznika [14C] do komórek oznaczano w pożądanych odstępach czasu, po solubilizacji komórek 0,5% SDS (a). Alternatywnie, komórki równoważono za pomocą [14C] mocznika w DMEM, 10% FCS przez godzinę w 37 ° C, i radioaktywność związaną z komórkami określono jak powyżej po przemyciu PBS-BSA w 4 ° C i dalszej inkubacji (b). (c i d) Szybkość napływu mocznika lub wypływu komórek (wyrażona jako procent maksymalnej zawartości po pierwszych 5 minutach oznaczania) została określona w próbach kontrolnych (wypełnione słupki) lub w upakowanych VacA (otwarte słupki) nieróżnicowanych liniach komórkowych, jak określono . Wartości są średnią z co najmniej trzech eksperymentów przeprowadzanych w dwóch egzemplarzach. SE. Ryc. 4. Ocena odpowiedzi, selektywność, kinetyka i zależność energetyczna indukowanej VacA permeabilizacji błony komórkowej komórek AGS. (a) Niespolaryzowane komórki AGS zostały odurzone przy rosnącym stężeniu VacA, a szybkość wytrącania mocznika została określona po osiągnięciu równowagi. Wkład: komórki AGS traktowano jak powyżej VacA (50 nM), płukano i inkubowano z PBS-BSA w temperaturze 4 ° C z dodatkiem 45 | jM [14C] mocznika (U), [14C] tiomocznika (TU), lub [ 3H] glicerol (Glik). Ilość uwolnionej radioaktywności określono po 5 minutach. Dane są średnią z trzech do czterech eksperymentów przeprowadzanych w dwóch egzemplarzach. SE
[patrz też: szczepionki na pneumokoki, przechowywanie kosmetyków, osłabienie organizmu przyczyny ]
[więcej w: maciej syka, olejowanie włosów kręconych, szczepionki na pneumokoki ]