Toksyna VacA Helicobacter pylori jest permeazą mocznika, która promuje dyfuzję mocznika w nabłonku

Ureaza i cytotoksyna VacA są dwoma głównymi czynnikami wirulencji ludzkiego patogenu, Helicobacter pylori, który jest odpowiedzialny za ciężkie choroby żołądkowo-jelitowe. Dyfuzja mocznika, substratu ureazy do żołądka jest krytycznie wymagana dla przetrwania zakażenia H. pylori. Teraz pokazujemy, że VacA zwiększa przepływ przeznabłonkowy mocznika przez model nabłonka poprzez indukowanie nienasyconej ścieżki przenikania. Ta transkomórkowa droga jest selektywna, ponieważ prowadzi tiomocznik, ale nie glicerol i mannitol, co pokazuje, że nie jest to spowodowane rozluźnieniem połączeń międzykomórkowych. Eksperymenty przeprowadzone z różnymi liniami komórkowymi, hodowane w niespolaryzowanym stanie, potwierdzają, że VacA przepuszcza membranę plazmatyczną komórki do mocznika. Badania hamowania wskazują, że pory transbłonowe utworzone przez VacA działają jako pasywne przenośniki mocznika. Zatem ich hamowanie przez bloker anionowy blokera kwasu 5-nitro-2- (3-fenylopropyloamino) benzoesowego znacząco zmniejsza indukowane przez toksynę strumienie mocznika zarówno w spolaryzowanych, jak i niepolaryzowanych komórkach. Ponadto flore tina, dobrze znany inhibitor transporterów mocznika eukariotycznego, blokuje transport mocznika i jonów za pośrednictwem VacA oraz główne efekty biologiczne toksyny. Dane te pokazują, że VacA zachowuje się jak aktywowany w niskich stężeniach, pasywny przenośnik mocznika potencjalnie zdolny do przepuszczania nabłonka żołądka do mocznika. Otwiera to nową możliwość, że VacA in vivo może faworyzować infekcyjność H. pylori poprzez optymalizację aktywności ureazy. Wprowadzenie Infekcja Helicobacter pylori (1, 2) determinuje zwiększoną częstość występowania nieżytów żołądka, wrzodów żołądka i dwunastnicy oraz gruczolakoraka żołądka i chłoniaków u ludzi. Kolonizacja żołądka przez ten drobnoustrój wymaga złożonych procesów adaptacyjnych. Wśród nich kluczową cechą jest tolerancja na kwas pozwalający bakterii na przekroczenie światła żołądka (pH 1. 2) i przetrwanie w warstwie śluzowej pokrywającej nabłonek żołądka (zakres pH od 1. 2 do 6). Śmierci komórkowej spowodowanej zakwaszeniem zapobiegają urazy cytozolowe, które przekształcają mocznik w amoniak i wodorowęglan (1-6). Te produkty hydrolizy mocznika są również substratami metabolicznymi dla H. pylori (7, 8). Znaczenie dostępności mocznika dla H. pylori potwierdza obecność aktywowanego kwasem pasywnego przenośnika mocznika (UreI) w wewnętrznej błonie bakteryjnej (9, 10) oraz pozytywna chemotaksja pasożyta w kierunku mocznika (11, 12). Oprócz ureazy, skuteczna kolonizacja żołądka przez H. pylori wymaga również cytotoksyny VacA (13). To około 88-kDa wydzielane białko jest głównym wirulentnym i patogennym czynnikiem, związanym z ciężkim uszkodzeniem tkanki żołądkowej (14). In vitro, VacA potrzebuje aktywacji kwasem wstępnym pH (15) i indukuje wakuolację komórek i różne efekty cytotoksyczne (2, 14, 16). VacA tworzy anionoselektywne kanały w modelach i błonach komórkowych (17. 20). Jednak znaczenie in vivo tych zjawisk dla zakażenia żołądka H. pylori i jego zmiany jest wciąż nieokreślone. Zbadaliśmy, czy VacA współpracuje z ureazą poprzez zwiększenie dyfuzji mocznika z tkanki śluzówki do światła żołądka. Hipoteza ta częściowo opiera się na wcześniejszych badaniach sugerujących, że funkcja VacA. In vivo polega na selektywnej permeabilizacji nabłonka żołądka na składniki odżywcze i inne użyteczne cząsteczki, poprzez zmianę połączeń komórkowych (21, 22) i / lub błon komórkowych (17, 20). Stosując spolaryzowane i niepolaryzowane komórki i błony modelowe oraz łącząc podejście funkcjonalne, farmakologiczne i elektrofizjologiczne, pokazano, że VacA determinuje szybki i selektywny wzrost przepuszczalności nabłonka do mocznika, poprzez wytwarzanie pasywnej i nienasyconej transkomórkowej ścieżki. Istnieją dowody, że tworzenie się porów VacA w błonie komórkowej komórki jest odpowiedzialne za zwiększoną przepuszczalność mocznika. Metody Odczynniki. VacA ze szczepu CCUG 17874 oczyszczono jak opisano wcześniej (23) i przechowywano w 4 ° C w PBS (pH 7,4). VacA aktywowano przez traktowanie przy pH 2,0, w 37 ° C przez 3 minuty. Komórki AGS i MKN28 były miłym prezentem V. Ricci (Institute of Human Physiology, University of Pavia, Pavia, Italy). Tworzywa sztuczne, podłoża hodowlane i FCS pochodziły z Life Technologies (Mediolan, Włochy). Filtry poliwęglanowe Transwell do różnicowania nabłonka in vitro (średnica porów 0,4 .m) pochodziły od Corning-Costar Corp. (Cambridge, Massachusetts, USA). [14C] Mocznik (57 michi / mmol), D- [14C] mannitol (56 mCi / mmol) i [1 (3) -3H] glicerol (3 Ci / mmol) pochodziły z Amersham Pharmacia Biotech (Mediolan, Włochy) . [14C] Tiomocznik (53 mCi / mmol) pochodził z NEN Life Science Products (Boston, Massachusetts, USA). Kwas 5-nitro-2- (3-fenylopropyloamino) benzoesowy (NPPB), floretina, benzenosulfonian (V) cysternochloroburku (pCMBS), ouabaina, 8Br-cAMP, 8Br-cGMP, kolagenaza Al, tiomocznik i mocznik pochodziły z firmy Sigma-Aldrich srl. (Mediolan, Włochy)
[przypisy: trojanek, jaka sukienka na ślub cywilny, maciej zagłoba zygler ]
[podobne: termometr microlife instrukcja obsługi, młody jęczmień w proszku, śliwka w czekoladzie kalorie ]