Wysoka częstość występowania białaczki u dużych zwierząt po terapii genowej komórek macierzystych za pomocą wektora retrowirusowego wyrażającego HOXB4 ad 7

W celu transdukcji komórki eksponowano na wektory retrowirusowe przy MOI wynoszącym 1. 2 przez 4 godziny w obecności czynników wzrostu. Po całonocnej hodowli w pożywkach zawierających czynniki wzrostu, komórki ponownie eksponowano na to samo MOI w stężonym wektorze przez 4 godziny. Natychmiast po tej drugiej ekspozycji, komórki zostały przemyte i podane w infuzji do śmiertelnie napromienionego zwierzęcia (920 cGy). Transdukcję i przeszczepianie komórek makaka opisano wcześniej (21). FACS. Cytometria przepływowa została wykorzystana do określenia poziomów znakowania zwierząt po transplantacji. Próbki krwi od zwierząt kontrolnych, które nie wyrażają GFP, użyto do bramkowania. Do analizy podzbioru komórek psich zastosowano przeciwciała CD3, CD21, CD14, CD34 i Dm5. Do analizy podzbiorów komórek makaka zastosowano przeciwciała CD3, CD20, CD14, CD13 i CD34. Morfologia. W celu wykonania morfologii przygotowano wycinki z biopsji szpiku lub sekcji. Szklane płytki barwiono plamą Wrighta-Giemsy. Zdjęcia cyfrowe wykonano mikroskopem Nikon. Patolodzy przeprowadzili analizę sekcji zwłok próbek tkanek psów i małp. Analiza Southern blot. Przeprowadzono Southern blot w celu określenia klonalności. DNA ze szpiku zwierząt ekstrahowano przy użyciu zestawu Puregene DNA Purification Kit (Gentra Systems). DNA (20 .g) trawiono przez noc Bglll, EcoRI lub SacI i poddano elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym. Zdenaturowane DNA przeniesiono na membranę nylonową N + i hybrydyzowano w roztworze QuickHyb (Amersham) z wyznakowanym 32P ires-GFP, który wycięto z plazmidu MSCV-HOXB4-ires-GFP. Sygnały hybrydyzacji zostały wykryte przy użyciu systemu obrazowania fosforu typu tajfun (Amersham Biosciences). Analiza witryny integracji. Analizę miejsca integracji przeprowadzono przy użyciu LAM-PCR, jak opisano poprzednio (22). Produkty PCR klonowano do wektora TOPO w celu sekwencjonowania. Pobrane sekwencje dopasowano do zgromadzenia genomu psa maj 2005 lub zespołu genomu Rheus macaque ze stycznia 2006 na stronie internetowej genomu przeglądarki University of California Santa Cruz (UCSC) (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat.polecenie = start & org = Dog [dla psów] i http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat.command=start&org=Rhesus [for rhesus]) w celu określenia stron integracji. Eksplozje knockdown. Białkowa linia komórkowa została uzyskana ze szpiku psa G374 w sekcji zwłok. Komórki hodowano w IMDM suplementowanej w 12,5% surowicy końskiej i 12,5% płodowej surowicy bydlęcej w obecności psiego SCF, trombopoetyny i Flt3-L, każdy przy 100 ng / ml. konstrukty shRNA wklonowano do wektora LMP (Open Biosystems), który poddał koekspresję gen purora. Obniżenie docelowych genów zostało potwierdzone przez PCR w czasie rzeczywistym. Pseudotypowane wektory wirusowe Phoenix RD114 wytworzono przez przejściową transfekcję komórek 293T. Komórki białaczkowe transdukowano wektorami wirusowymi i wybrano 5 .g / ml puromycyny następnego dnia. Wybrane komórki przechowywano w hodowli lub zbierano do ekstrakcji RNA i analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym. RT-PCR w czasie rzeczywistym. Całkowity RNA wyekstrahowano za pomocą RNeasy Mini Kit (Qiagen). Pozostały DNA wyeliminowano przez traktowanie DNazą I. Sekwencje mRNA pyska lub makaka zostały określone przez dopasowanie sekwencji ludzkiego RNA z sekwencjami genów psich lub makaków na stronie internetowej UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/). Odwrotną transkrypcję przeprowadzono przy użyciu systemu RT-PCR ThermoScript (Invitrogen). Startery zaprojektowano z programem Primer 3.0. W celu ilościowej analizy ekspresji genów, przeprowadzono PCR w czasie rzeczywistym SYBR Green w 7500 systemie PCR w czasie rzeczywistym (Applied Biosystems). Dane znormalizowano do GAPDH dla próbek małpy lub dla p-aktyny dla próbek psa. Monitorowanie reakcji PCR w czasie rzeczywistym klonów. Zaprojektowano dwa startery, jeden na transgen MSCV i drugi na sekwencji genomu miejsc integracji, w celu śledzenia wkładu klonu białaczkowego do hematopoezy. W przypadku PCR w czasie rzeczywistym SYBR Green, do utworzenia krzywej standardowej użyto próbek genomowego DNA ze szpiku podczas sekcji, zakładając, że wszystkie komórki HOXB4GFP + pochodziły z klonu białaczkowego, który był wspierany przez dane Southern blot. Western blot. Komórki szpiku kostnego od zwierząt białaczkowych i kontrolne zwierzęta normalne poddano ekstrakcji białka i analizie Western blot ekspresji HOXB4, która została szczegółowo opisana w innym miejscu (21). Statystyka. Przeanalizowaliśmy dane według dokładnego testu Fishera. Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za statystycznie istotne. Materiały uzupełniające Zobacz Dodatkowe dane Podziękowania Dziękujemy Bonnie Larson i Helen Crawford za pomoc w przygotowaniu manuskryptu Dziękujemy Jamesowi Fletcherowi i pracownikom National Primate Research Center Uniwersytetu Waszyngtońskiego za opiekę nad małpami i personelem laboratorium psów Fred Hutchinson Cancer Research Center za opiekę nad psami. Dziękujemy Barry Storer i Yi Cao za wykonanie analizy statystycznej. Ta praca została wsparta przez NIH granty HL53750, HL36444, HL74162, HL84345, DK56465 i DK47754. Przypisy Niestandardowe skróty: HOXB4, homeobox B4; MGMT, metylotransferaza metyloguaninowa; MSCV, wirus mysich komórek macierzystych; PRDM16, domena PR zawierająca 16; TSS, strona początkowa transkrypcji; YFP, żółte białko fluorescencyjne. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.118: 1502. 1510 (2008). doi: 10.1172 / JCI34371 Zobacz powiązany artykuł na HOXB4 i wektorach retrowirusowych: dodawanie paliwa do ognia.
[więcej w: śliwka w czekoladzie kalorie, paznokcie w dwóch kolorach, gregor laubsch ]
[podobne: maciej zagłoba zygler, maciej syka, olejowanie włosów kręconych ]