Wysoka częstość występowania białaczki u dużych zwierząt po terapii genowej komórek macierzystych za pomocą wektora retrowirusowego wyrażającego HOXB4 ad

Nasze badania pokazujące wpływ HOXB4 na komórki repopulacyjne krwiotwórcze u naczelnych innych niż człowiek zostały opublikowane wcześniej (21). Podobnie do naszych wyników u naczelnych innych niż ludzie, zaobserwowaliśmy wyższe poziomy komórek wykazujących nadekspresję HOXB4 we wczesnym okresie po transplantacji w porównaniu z poziomami po miesiącu u psów (Suplementowa Figura 1, materiał uzupełniający dostępny online w tym artykule; doi: 10.1172 / JCI34371DS1). Jeden z 3 psów, które otrzymały transdukowane HOXB4 komórki CD34 + zmarł 3 miesiące po transplantacji z powodu powikłań związanych z transplantacją. Pozostałe 2 psy (G374 i G450) obserwowano przez 2 lata. Około 15 miesięcy po transplantacji obserwowaliśmy spontaniczne zwiększenie liczby komórek znakowanych HOXB4 u psów G374 i G450, podczas gdy komórki kontrolne oznaczone żółtym fluorescencyjnym białkiem. (Komórki znakowane YFP) stopniowo zmniejszały się do <0,1% (Figura 1, A i B). Ten sam wzór zaobserwowano u makaka K00339 w 22 miesiące po przeszczepie (Figura 1C). Figura Rozwój białaczki u 2 psów i maka przeszczepionego komórkami CD34 + z nadekspresją HOXB4. Poziomy znakowania w granulocytach u psów G374 (A) i G450 (B) i makak K00339 (C). Reprezentatywna morfologia szpiku podczas sekcji dla G374 (D), G450 (E) i K00339 (F). W szpiku obserwowano dużą liczbę komórek blastycznych. Analiza podzbiorów próbek szpiku z G374 (G), G450 (H) i K00339 (I). Po lizie czerwonych krwinek komórki komórek szpikowych barwiono przeciwciałami przeciwko markerowi limfocytów T CD3, markerowi limfocytów B CD20 lub CD21, markerowi monocytarnemu CD14, markerowi granulocytarnemu Dm5 lub CD13 i markerowi CD34 komórek macierzystych / progenitorowych. Pies G374 rozwinął zwiększoną liczbę krwinek białych ze wzrostem monocytów i zmniejszeniem liczby płytek krwi (Suplementowa Figura 2). Analiza szpiku potwierdziła rozpoznanie ostrej białaczki mielomonocytowej (ryc. 1D). U psa G450 wystąpiła pancytopenia i zwiększona liczba białaczkowych komórek blastycznych we krwi obwodowej 20 miesięcy po transplantacji (dodatkowa Figura 3). Analiza szpiku kostnego i krwi obwodowej potwierdziła rozwój ostrej białaczki szpikowej (AML) (ryc. 1E). Dwadzieścia pięć miesięcy po transplantacji makak K00339 opracował zmniejszony hematokryt, wzrost czerwonych krwinek zarodkowych i ostatecznie wzrost liczby białych krwinek za pomocą krążących blaszek (Suplemental Rysunek 4). Analizy szpiku potwierdziły AML (ryc. 1F). Wszystkie zwierzęta poddano eutanazji ze względu na pogarszającą się kondycję fizyczną związaną z białaczką. Badanie patologiczne szpiku kostnego i innych tkanek potwierdziło rozpoznanie białaczki. Blaszki białaczkowe z G450 i K00339 eksprymowały CD34 (Figura 1, G. I), podczas gdy tylko około 1% blastów było CD34 + w G374. Jednakże białkowa linia komórkowa pochodząca z CD34 eksprymowanego w G374 (patrz Figura 3C). Figura 3 Nadekspresja HBOX4 przyczynia się do leukemogenezy. (A) Analiza Western blot wykazała silną ekspresję HOXB4 w komórkach szpiku od zwierząt białaczkowych. Komórki psa wykazujące nadekspresję HOXB4 w hodowli ex vivo zastosowano jako kontrolę dodatnią i komórki szpiku od normalnego psa jako kontrolę negatywną. (B) Knockdown PRDM16 lub MYB zmniejszył szybkość proliferacji komórek białkowych G374 u psów. (C) knockdown HOXB4 w indukowanej komórce białaczkowej różnicowania komórek i (D) zlikwidował proliferację komórek. Marker komórek macierzystych CD34 i dojrzały marker granulocytów Dm5 zastosowano do oceny różnicowania komórek. Białą linię komórkową hodowano w podłożu suplementowanym cSCF, trombopoetyną i Flt3-L, każdy po 100 ng / ml. Łącznie obserwowaliśmy rozwój białaczki u 3 zwierząt. We wszystkich 3 przypadkach białaczka powstała w komórkach wyrażających HOXB4GFPa, ale nie w komórkach wyrażających YFP, co sugeruje, że HOXB4 jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do białaczki (P = 0,05). Mutageneza indukowana przez Gammaretrovirus jest związana z białaczką. Aby zbadać klonalność białaczki, przeprowadziliśmy analizy Southern blot. W G374 wykryliśmy 2 prążki o tej samej intensywności, co sugeruje klon z 2 miejscami integracji (rysunek 2A). Analiza próbek DNA z różnych punktów czasowych po transplantacji potwierdziła ten wynik (Dodatkowa Figura 5). W G450 wykryliśmy zespół, demonstrując klon z miejscem integracji. DNA z K00339 wykazało 5 pasm o tej samej intensywności, co sugeruje dominujący klon z 5 miejscami integracji. Analiza PCR każdego integranta przy użyciu DNA z pojedynczej kolonii pochodzącej ze szpiku kostnego K00339 potwierdziła tę interpretację (dane nie pokazane). Ryc. 2. Mutageneza indukowana integracjatem jest związana z białaczką [hasła pokrewne: artur szudrowicz, olej z konopii indyjskiej, maciej syka ] [więcej w: jacek bryndal, klaudia el dursi, 5lo bydgoszcz ]