Wysoka częstość występowania białaczki u dużych zwierząt po terapii genowej komórek macierzystych za pomocą wektora retrowirusowego wyrażającego HOXB4 cd

Analiza Southern blot próbek szpiku z G374, G450 i K00339 wykazuje monoklonalność. DNA szpiku został strawiony BglII, który przecina transgen raz, uwalniając unikalne pasmo dla każdego integranta. Trawienie za pomocą SacI, które dwukrotnie przecinają transgen, wykazało prążek 3,9 kb dla wszystkich integrantów. (BdD) Miejsca integracji określono za pomocą LAM-PCR, i pokazano schematyczne reprezentacje miejsc integracji dla G374 (B), G450 (C) i K00339 (D). Egzony są reprezentowane przez czarne skrzynki. MSCV wskazuje miejsce integracji, a strzałka wskazuje orientację. ATG oznacza stronę początkową tłumaczenia. Zwróć uwagę, że eksony i introny nie mają skali. (E. G) Rozregulowana ekspresja genów w bliskim sąsiedztwie miejsc integracji dla G374 (E), G450 (F) i K00339 (G). Przeprowadzono RT-PCR SYBR Green w czasie rzeczywistym w celu określenia poziomów ekspresji psa MYB (E), psa ZFP36L2 i związanego z gruczolakiem tarczycy (THADA) (F) i makaka PRDM16, SSBP2 i SOCS1 (G). Ekspresja psiego PRDM16 (E) i makaka MAGOH2 (G) była niewykrywalna w próbkach od normalnych zwierząt kontrolnych. (G) Ekspresja NSMCE1 była niewykrywalna u K00339 i zwierząt kontrolnych. Próbki mRNA szpiku z normalnych zwierząt zastosowano jako kontrole. M, drabina DNA. Miejsca integracji określono metodą LAM-PCR (22). U psa G374 wektor został włączony w 100 kb powyżej miejsca startu transkrypcji c-myb (TSS) w orientacji odwrotnej, a drugi prowirus został zintegrowany z intronem 3 domeny PR zawierającym 16 (PRDM16) w tej samej orientacji ( Figura 2B). W G450 wektor został zintegrowany z 90 kb za ZFP36L2 TSS (Figura 2C). Co ciekawe, zaobserwowaliśmy również miejsce integracji w intronie PRDM16 w K00339 (rysunek 2D). Dwa integranty tego zwierzęcia znajdowały się na intronach jednoniciowego białka wiążącego DNA 2 (SSBP2) i niestrukturalnego utrzymywania homologu pierwiastka chromosomu (NSMCE1) w orientacji odwrotnej, a 2 inne integranty miały 640 bp powyżej homologu mago-nashi 2 ( MAGOH2) i 60 kb w dół od SOCS1 TSS (rysunek 2D). Następnie zbadaliśmy, czy integracja wektora w onkogenach spowodowała zmienioną ekspresję onkogenu przy użyciu RT-PCR w czasie rzeczywistym. W szpiku z G374 wykryto ekspresję PRDM16, podczas gdy w normalnych próbkach kontrolnych PRDM16 był niewykrywalny (Figura 2E). Dalsza analiza wykazała, że 5. LTR połączono w eksonie 4, aktywując krótką izoformę PRDM16 (Suplementowa Figura 6), która nie ma domeny PR i doniesiono, że odgrywa ważną rolę w leukemogenezie (23). Ponadto ekspresja MYB również została podwyższona. W G450 integracja w locus ZFP36L2 była związana ze zwiększoną ekspresją ZFP36L2 i ekspresją towarzyszącą gruczolakowi tarczycy (THADA) w porównaniu z kontrolnymi komórkami szpiku kostnego (Figura 2F). W szpiku kostnym K00339 wykryliśmy zwiększoną ekspresję PRDM16 i SOCS1 oraz zmniejszoną ekspresję SSBP2, supresora guza (Figura 2G). Biorąc pod uwagę, że ekspresja SOCS1 została obniżona w wielu komórkach białaczkowych (24), może to sugerować, że miejsce integracji w locus SOCS1 nie przyczyniło się do białaczki. Wyrażenie NSMCE1 było niewykrywalne we wszystkich próbkach, co sugeruje, że jest to. Pasażer. strona integracyjna. Wykazano również, że integracja wirusa powyżej TSS aktywuje ekspresję MAGOH2; jednak jego funkcja w komórkach ssaków jest w dużej mierze nieznana. Podsumowując, upregulacja PRDM16 i obniżenie poziomu SSBP2, między innymi rozregulowane geny, prawdopodobnie przyczyniły się do rozwoju białaczki u tego zwierzęcia. Nadekspresja HOXB4 odpowiada za białaczkę. Analiza metodą cytometrii przepływowej wykazała wysoki poziom ekspresji HOXB4GFP u tych zwierząt, co potwierdzono metodą western blot (Figura 3A). W celu dalszego zbadania mechanizmów leżących u podstaw leukemogenezy, ustaliliśmy białą linię komórkową ze szpiku kostnego G374; linia ta rośnie silnie w obecności cytokin i wyraża CD34. Zaprojektowaliśmy shRNA do PRDM16, MYB i HOXB4, aby określić, czy zwiększona ekspresja tych genów przyczyniła się do rozwoju białaczki. Jak pokazano na Figurze 3B, obniżenie ekspresji PRDM16 i MYB tylko zmniejszyło szybkość proliferacji komórek podczas 3-tygodniowego okresu hodowli bez zmiany odsetka komórek CD34 + i bez różnicowania. Przeciwnie, obniżenie poziomu HOXB4 spowodowało całkowite zniknięcie komórek CD34 +, a większość komórek eksprymowała dojrzały marker granulocytów Dm5 po 2 tygodniach (Figura 3C). Odkrycia te pokazują, że knockdown HOXB4 spowodował różnicowanie komórek białaczkowych. Ponadto zróżnicowane komórki przestały rosnąć po 3 tygodniach
[podobne: ciśnieniomierz elektroniczny, olej kokosowy na zmarszczki, śliwka w czekoladzie kalorie ]
[hasła pokrewne: jaka sukienka na ślub cywilny, olej kokosowy na zmarszczki, olej z konopii indyjskiej ]