Wysoka częstość występowania białaczki u dużych zwierząt po terapii genowej komórek macierzystych za pomocą wektora retrowirusowego wyrażającego HOXB4 czesc 4

Dane te wykazują zdolność HOXB4 do współdziałania z kluczowymi genami współpracującymi w celu promowania samoodnawiania komórek macierzystych i hamowania różnicowania się komórek w klonach białaczkowych, co ostatecznie prowadzi do jawnej białaczki. Podsumowując, dane te sugerują, że HOXB4 odegrał kluczową rolę w leukemogenezie dzięki swojej zdolności do skutecznej współpracy ze współpracującymi mutagennymi zdarzeniami. Dynamika klonów białaczkowych. Do śledzenia i ilościowego oznaczenia klonów białaczkowych u zwierząt zastosowano analizę PCR w czasie rzeczywistym SYBR Green (Figura 4, ACH). W okresie od do 2 miesięcy po transplantacji tylko 0,01%. 0,1% komórek krwi obwodowej stanowiły klony białaczkowe. W okresie od 6 do 12 miesięcy wkład wzrósł do około 1% we krwi obwodowej i do 10% w komórkach szpiku kostnego. W kolejnym roku nie było jednak żadnych znaczących zmian. Co ciekawe, klon białaczkowy w szpiku G374 wzrósł do 10% po 6 miesiącach po przeszczepie, ale zmniejszył się do mniej niż 1% po 11 miesiącach po transplantacji. Dane te są zgodne z wynikami cytometrii przepływowej (Figura 1A i dane nie pokazane) i analizą Southern blot (Dodatkowa Figura 5). Rysunek 4Zwiększanie względnego znakowania klonów białaczkowych w czasie. Przeprowadzono PCR w czasie rzeczywistym dla psów G374 (A) i G450 (B) i makaków K00339 (C) przy użyciu starterów specyficznych dla LTR i chromosomów. Pokazano wartości względne, które znormalizowano do P-aktyny lub GAPDH, które ilościowo określają całkowity genomowy DNA. Standardowe krzywe zostały wygenerowane przy użyciu szeregu 8 rozcieńczeń próbek DNA z sekcji zwłok z każdego zwierzęcia. PB, krew obwodowa. Opóźnienie około roku przed wystąpieniem jawnej białaczki u wszystkich zwierząt sugeruje, że więcej mutacji mogło się nagromadzić w tym okresie czasu, prowadząc do rozwoju blastów białaczkowych. Analiza kariotypu komórek szpikowych od 3 zwierząt białaczkowych nie wykryła jednak żadnych wady brutto (dane nie przedstawione). Nie wyklucza to możliwości delecji genów i duplikacji oraz akumulacji losowych mutacji nukleotydów, które nie zostałyby wykryte w standardowej analizie kariotypu. Charakterystyka innego makaka z normalną hematopoezą. Jeden (K03290) z 2 makaków, które obserwowano przez ponad 28 miesięcy, nie wykazał dotąd żadnych oznak nieprawidłowości. Poziomy znakowania w granulocytach obwodowych ustabilizowały się na poziomie 10% dla HOXB4 i 2% dla YFP (Figura 5A). Analiza Southern błot DNA z komórek szpiku HOXB4GFP + ujawniła wiele pasm, wskazujących na poliklonalną hematopoezę (Figura 5B). Analiza LAM-PCR komórek HOXB4GFP + wykazała 9 miejsc integracji (Tabela 1), wśród których opisano mitochondrialne białko S23 (MRPS23), CD9, MMP8 i IGFBP8 zaangażowane w proces tworzenia się nowotworu. Tak więc, nawet w przypadku miejsc integracji w loci onkogenów, makak ten nie rozwinął jeszcze złośliwości. Figura 5 Charakterystyka makaka K03290, zwierzęcia z prawidłową hematopoezą. (A) Oznaczenie poziomów K03290 we krwi obwodowej, która została ustabilizowana przez ponad 2 lata. (B) Analiza Southern blot wykazała wiele pasm komórek szpiku z nadekspresją HOXB4. Trawienie za pomocą SacI, które dwukrotnie przecinało transgen, wykazało prążek 3,9 kb dla wszystkich integrantów. Bglll i EcoRI przecinały transgen jeden raz, a zatem każde pasmo wskazuje indywidualny integrant. Tabela Miejsca integracji uzyskane z komórek wykazujących nadekspresję HOXB4 w K03290 Brak dowodów na nieprawidłowości u zwierząt, które otrzymały transdukowane komórki MGMT. W przeciwieństwie do 3 z 4 zwierząt, u których rozwinęła się białaczka po transplantacji komórek transdukowanych HOXB4, żaden z ponad 40 psów i małp nie przeszczepił transdukowanych komórek z wykorzystaniem transgenów innych niż HOXB4 i następował przez średnio 3 lata z poziomami znakowania wyższymi niż 1% rozwinęło białaczkę (p <0,001). Wśród tych zwierząt było 5 psów, które otrzymały transdukowane komórki MGMTGFP przy użyciu tego samego wektora retrowirusowego opartego na mysim wirusie z komórek macierzystych (opartym na MSCV), jaki zastosowano w badaniach HOXB4. Zwierzęta te otrzymały również wiele rund chemioterapii po transplantacji w celu zwiększenia poziomów znakowania (25, 26). Pięć lat po transplantacji oznaczenie ustabilizowało się na wysokim poziomie, w szczególności na granulocytach (tabela 2). Analiza krwi obwodowej i szpiku wykazała prawidłową hematopoezę bez objawów białaczki (Figura 6A). Ponadto analiza Southern blot DNA szpiku kostnego z tych zwierząt wykazała wiele pasm, wykazując poliklonalność (Figura 6B). Ryc. 6 Normalna hematopoeza u psów, które otrzymały transdukowane komórki MGMT przy użyciu wektora retrowirusowego MSCV [hasła pokrewne: benzoesan sodu szkodliwość, śliwka w czekoladzie kalorie, olejowanie włosów kręconych ] [więcej w: warsaw shore odcinek 3 kinomaniak, marcin nikrant, olga jahr ]