Zwiększona ekspresja receptora C5a w sepsie ad 5

Aby dodatkowo potwierdzić hamowanie wiązania 125I-C5a przez a C5aR, przeprowadziliśmy doświadczenia wiązania u myszy in vivo, 6 godzin po CLP (Figura 3b). Aby zablokować wiązanie 125I-C5a, A5aR był podawany (jak opisano powyżej) 15 minut przed wlewem 125I-C5a. 125I-C5a wstrzyknięto dożylnie 10 minut przed uśmierceniem zwierząt. Wyraźne zahamowanie wiązania 125I-C5a stwierdzono we wszystkich czterech narządach, ale nie osiągnęło statystycznego znaczenia w płucach (n = 4). Wyniki na Figurze 3 pokazują, że. C5aR hamuje znacząco wiązanie 125I-C5a in vitro i in vivo. Figura 3 Hamowanie wiązania wyznakowanego 125I mysiego C5a (125I-C5a) z otrzewnowymi mysimi neutrofilami in vitro (a) i różnymi narządami in vivo (b) przez a C5aR. (a) Wiązanie 125I-C5a jest wyrażone jako cpm. Grupy traktowano (jak wskazano) przez 20 minut przed wiązaniem 125I-C5a. Dane są reprezentatywne dla pięciu niezależnych eksperymentów na warunek. (b) Wiązanie 125I-C5a wyraża się jako stosunek cpm na gram narząd do cpm w 100. l krwi od każdego zwierzęcia (n = 4 na stan) uzyskanej 10 minut po dożylnym wstrzyknięciu 125 I-C5a i 6 godzin po CLP . . C5aR (6 .g / mysz) lub jednakową ilość nieistotnego króliczego IgG (kontrola) podawano dożylnie 15 minut przed wlewem 125I-C5a. * Istotność statystyczna w grupach leczonych w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Ctrl, kontrola. Zwiększona ekspresja mRNA dla C5aR podczas posocznicy wywołanej przez CLP u myszy. W celu dalszego rozszerzenia wyników eksperymentów wiązania in vivo, przeprowadziliśmy eksperymenty RT-PCR. Rysunek 4 podsumowuje wyniki tych eksperymentów. W każdym z czterech badanych narządów zaobserwowano wzrost ilości mRNA dla C5aR podczas wystąpienia posocznicy wywołanej przez CLP, z grubsza skorelowany ze zwiększonym wiązaniem narządów 125I-aC5aR (Figura 1). W płucach obserwowano wzrost mRNA dla C5aR w półilościowym RT-PCR 6 godzin po CLP (ale nie po 3 godzinach). W wątrobie, nerkach i sercu zwiększone poziomy mRNA C5aR można było zaobserwować już po 3 godzinach od wystąpienia CLP. W wątrobie, płucach i sercu szczytowy wzrost ekspresji mRNA C5aR nastąpił 6 godzin po CLP, podczas gdy w nerkach stwierdzono stały wzrost nawet o 12 godzin po CLP. Eksperymenty RT-PCR sugerują zwiększoną ekspresję genu dla C5aR we wczesnej sepsie, zgodnie z obserwowanym wzrostem wiązania 125I-a5aR do tych samych narządów. W danych niepokazanych, gdy jelita cienkie i mózg oceniano 12 godzin po CLP pod kątem zwiększonego wiązania 125I-aC5aR lub zwiększonej zawartości mRNA dla C5aR, nie zaobserwowano żadnych wzrostów, co sugeruje, że zmiany w mRNA C5aR nie są globalne. Ryc. 4 Racjonalny RT-PCR dla mRNA C5aR w płucach, wątrobie, nerkach i sercu. RT-PCR przeprowadzono przy użyciu RNA izolowanego 0, 3, 6 i 12 godzin po CLP. W przybliżeniu jednakowe obciążenie produktu DNA wykazano przez ekspresję mRNA GAPDH (dolna połowa każdego panelu). Wyniki są reprezentatywne dla dwóch niezależnych i oddzielnych eksperymentów dla każdej grupy i punktu czasowego. Immunohistochemiczne zabarwienie płuc, wątroby, nerek i serca podczas sepsy. W oparciu o dowody zwiększonej ekspresji mRNA dla C5aR i zwiększonego wiązania in vivo z 125I-a5aR, przeprowadziliśmy barwienie immunohistochemiczne narządów w celu odpowiedzi na pytanie, gdzie w tkankach zwiększono ekspresję białka C5aR. Figura 5 przedstawia wyniki barwienia immunohistochemicznego w odcinkach z płuc, wątroby, nerki i serca uzyskanych od myszy kontrolnych i myszy CLP po 12 godzinach. W płucach wyniki ujawniły wzorce barwienia głównie w komórkach nabłonka oskrzelowego. W wątrobie obserwowano dyfuzyjne barwienie hepatocytów i komórek sinusoidalnych w przeciwieństwie do barwienia tkanek u myszy kontrolnych. W nerkach CLP spowodowało drastyczne zwiększenie barwienia białka C5aR w bliższych i dalszych komórkach nabłonka kanalików, ale nie w kłębuszkach. W sercu, 12 godzin po CLP wystąpiło rozproszone barwienie miocytów. Zgodnie z tym, CLP powoduje wyraźną ekspresję białka C5aR w narządach, w którym już wykazaliśmy, że mRNA dla C5aR i wiązanie 125I-a5aR były zwiększone. Ryc. 5Immunohistochemiczne zabarwienie sekcji narządów dla C5aR myszy, jak wskazano w tekście. Porównano wyniki barwienia z sekcji narządów od zwierząt kontrolnych (lewe panele) i od zwierząt 12 godzin po CLP (prawe panele). Wyniki są reprezentatywne dla trzech do sześciu wybarwień z dwóch niezależnych eksperymentów na stan. Powiększenie, × 20; wypustki w prawych panelach, x 40 (zabarwienie hematoksyliną). Wpływ leczenia a C5aR lub A C5a IgG u myszy CLP. W celu zbadania roli. C5aR i. C5a na przeżywalność w posocznicy wywołanej CLP u myszy, 20. G. C5aR IgG lub. C5a wstrzyknięto dożylnie w objętości 200. DPBS myszom bezpośrednio po indukcji CLP, i. w przypadku C5aR także w 6 godzin po CLP
[patrz też: maciej syka, trojanek, śliwka w czekoladzie kalorie ]
[więcej w: gregor laubsch, artur szudrowicz, joanna derybowska ]