Zwiększona ekspresja receptora C5a w sepsie ad

Całkowity RNA izolowano z tkanki wątroby od normalnych myszy przy użyciu metody izotiocyjanianu guanidyny. Mysią sekwencję C5a subklonowano do wektora ekspresyjnego pET 15b (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) stosując następujące startery: 5 (3-GTG TCG CGA GTC AGC CAT ATG AAC CTG CAT CTC CTA-3. (sens, miejsce NdeI podkreślone) i 5 -GTC ACA TCG CGA CAC GGA TCC TCA CCT TCC CAG TTG GAC-3. (podkreślono antysensowną, miejsce BamHI). Po ekspresji mysiego C5a w komórkach BL21 (DE3) pLysS (Novagen) rekombinowane białko oczyszczono na kolumnie Ni ++ i dializowano za pomocą układu rur (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA). Aktywność biologiczną C5a potwierdzono przeprowadzając eksperymenty chemotaksji z mysimi neutrofilami. Eksperymentalna sepsa wywołana CLP i przygotowanie narządów. Siedmio- lub ośmiotygodniowe specyficzne wolne od patogenu samce myszy BALB / c (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA) zastosowano we wszystkich badaniach. Znieczulenie osiągnięto przez dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu soli buforowanej fosforanem (Ketamina / Ksylazyna / Dulbecco) (11 .l / g masy ciała), w którym ml Ketaminy zawierającej 9% ksylazyny rozcieńczono 7 ml DPBS . W modelu CLP około dwie trzecie jelita ślepego poddano podwiązaniu za pomocą nacięcia w linii środkowej brzucha o długości 1,5 cm. Zligowaną część jelita ślepego przebito przez igłę 21 G przez igłę. Po zmianie położenia jelita, jamę brzuszną zamknięto warstwami, stosując szew chirurgiczny 4.0 (Ethicon Inc., Somerville, New Jersey, USA) i metalowe klipsy. Zwierzęta pozorowane poddano tej samej procedurze bez podwiązania lub przebicia ślepego kąta. W przypadku ofiar ze zwierząt, dolna żyła główna została nacięta, a około 600 l krwi usunięto. Klatkę piersiową następnie otwarto i tętnicę płucną powoli perfundowano za pomocą 40 ml DPBS, przy czym ciecz perfuzyjna mogła wyciekać z otwartej dolnej żyły głównej po perfuzji. Jakość perfuzji była kontrolowana optycznie poprzez obserwację zmiany koloru narządów (na biały), gdy krew została całkowicie usunięta. Następnie narządy pobrano do analizy radioaktywności lub szybko zamrożono do eksperymentów RT-PCR i barwienia immunohistochemicznego. W płucach wykonano płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe o całkowitej objętości 3 ml. Badania wiązania in vivo. Poliklonalne królicze anty-mysie C5aR IgG, które oczyszczono przez powinowactwo lub całe królicze IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pensylwania, USA) oznaczono 125I, stosując metodę chloraminę, jak opisano w innym miejscu (22). Protokół ten umożliwiał delikatne utlenianie. Tę samą metodę zastosowano do znakowania rekombinowanej mysiej C5a. W przypadku badań wiązania, posocznicę indukowano za pomocą CLP, a zwierzęta uśmiercono 3, 6 i 12 godzin później. Radioaktywność narządów porównywano do radioaktywności w kontrolowanych zwierzętach. Sto nanogramów znakowanego 125I anty-mysiego C5aR IgG (125I-aC5aR) razem z 2 (ig niezaznaczonego przeciwciała jako nośnikiem w całkowitej objętości 200 ul DPBS podano dożylnie 15 minut przed uśmierceniem zwierząt. Do badań wiązania z myszą C5a znakowaną 125I, 100 ng 125I-C5a razem z 2 ug nieznakowanego C5a w 200 ul DPBS wstrzyknięto dożylnie 10 minut przed uśmierceniem zwierząt. Dwieście mikrolitrów krwi pobrano z żyły w jamie brzusznej w celu oznaczenia ilości radioaktywności we krwi 15 minut po wstrzyknięciu 125I-aC5aR i 10 minut po wstrzyknięciu 125 I-C5a. Narządy następnie dokładnie przepłukano DPBS, a następnie zebrano (jak opisano powyżej) i zważono. Radioaktywność mierzono w liczniku gamma (1261 Multi-A, Wallac Co., Gaithersburg, Maryland, USA). Dane wyrażono jako cpm na g tkanki, podzielone przez cpm w 100 .l próbki krwi dla każdego indywidualnego zwierzęcia. Podobne eksperymenty przeprowadzono, stosując myszy z niedoborem granulocytów obojętnochłonnych jako kontrole. Zmniejszenie neutrofilów osiągnięto za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego króliczych przeciwciał przeciwko mysiej polimorfojądrowej neutrofilowej IgG (Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, New York, USA) 18 godzin przed indukcją CLP, zgodnie z instrukcjami producenta. Izolacja mysich neutrofili i badania wiązania in vitro. W celu izolacji neutrofilów, 8-tygodniowe myszy BALB / c wstrzyknięto dootrzewnowo 3 ml 2,4% roztworu tioglikolanu (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) przez 5 godzin. Następnie myszy uśmiercono i wycięto cm2 skórę z mięśni brzucha. 3 x 10 ml DPBS wstrzyknięto dootrzewnowo, i płyn z płukania otrzewnej zebrano i utrzymywano w 4 ° C. Neutrofile następnie zliczono przy użyciu mikroskopu optycznego, odwirowano przy 700 g przez 10 minut i zawieszono w HBSS zawierającym 1% BSA (Sigma Chemical Co., St.
[podobne: olej z konopii indyjskiej, śliwka w czekoladzie kalorie, trojanek ]
[patrz też: jaka sukienka na ślub cywilny, olej kokosowy na zmarszczki, olej z konopii indyjskiej ]