Ścieżka MEKK1-JNK odgrywa rolę ochronną w przeciążeniu ciśnieniowym, ale nie pośredniczy w przeroście mięśnia sercowego ad

Jeden został wprowadzony do prawej tętnicy szyjnej, a drugi do lewej tętnicy udowej, a następnie ostrożnie przeszli oni do aorty wstępującej i aorty brzusznej, gdzie ciśnienie mierzono jednocześnie. Gradienty ciśnienia pomiędzy ciśnieniem skurczowym w aorcie wstępującej a gradientem w aorcie brzusznej obliczono jak opisano (21). Echokardiografia. Myszy znieczulono jak opisano powyżej. Badanie echokardiograficzne przeprowadzono przy użyciu ultrasonografii (Apogee CX-200, Interspec Inc., Amber, Pennsylvania, USA), jak opisano wcześniej (23). Dynamicznie skupiony przetwornik 9-MHz z pierścieniową matrycą zastosowano od dołu, używając rozgrzanego woreczka z solą fizjologiczną jako dystans. Pomiary w trybie M wewnętrznej średnicy lewej komory (LV) wykonano z więcej niż trzech uderzeń i uśredniono. Pomiary średnicy końcowo-rozkurczowej lewej komory (LVEDD) zostały wykonane w momencie pozornego maksymalnego rozkurczowego wymiaru LV, podczas gdy pomiary końcowej średnicy skurczowej lewej komory (LVESD) zostały wykonane w czasie najbardziej przedniego skurczowego skoku tylnego Ściana. Frakcja wyrzutowa LV (LVEF) została obliczona w metodzie sześciennej w następujący sposób: LVEF = [(LVEDD) 3. (LVESD) 3] / (LVEDD) 3. Ocena aktywności MAPK. Serie homogenizowano za pomocą buforu do lizy zawierającego 25 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM pirofosforanu sodu, 10 mM P-glicerofosforanu, mM Na3VO4, 1% (obj./obj.) Triton X-100, 10% (obj./obj.) Glicerolu, mM ditiotreitolu, mM PMSF i 10 .g / ml aprotyniny. Równe ilości homogenatu serca (100 .g) rozdzielano przez SDS-PAGE na 10% (wag./obj.) Żelach i przenoszono na membrany PVDF. Filtry poddano analizie immunoblot z użyciem przeciwciała anty-fosfo-JNK (nr 9255, Cell Signaling Technology Inc., Beverly, Massachusetts, USA), przeciwciała anty-fosfo-ERK (nr 9106, Cell Signaling Technology Inc.), lub przeciwciało anty-fosfo-p38 (nr 9211, Cell Signaling Technology Inc.). Podwójne próbki poddano analizie immunoblot z użyciem przeciwciała anty-JNK1 (sc-474; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California, USA). Niektóre filtry zostały odpędzone i ponownie odsłonięte przeciwciałem anty-ERK (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, California, USA) lub przeciwciałem anty-p38 (nr 9212, Cell Signaling Technology Inc.). Bloty oznaczono ilościowo metodą densytometrii skaningowej za pomocą skanera laserowego, stosując obraz NIH. Aktywność JNK1 określono również w teście kinazy immunologicznej z użyciem przeciwciała anty-JNK1 i transferazy S-glutationu (c-Jun (aminokwasy 1: 79) (Santa Cruz Biotechnology Inc.), jak opisano wcześniej (24). Analizy histologiczne. Lewe komory, z przegrodą, pocięto na podstawę, część środkową i wierzchołek, utrwalono za pomocą formaliny, zatopiono w parafinie i podzielono na 6. M grubości. Skrawki inkubowano w 3% H2O2 w PBS w celu zablokowania endogennej peroksydazy i zablokowano 5% BSA w PBS. Pierwotne przeciwciała rozcieńczono przy 1,3. 3. G / ml w PBS i naniesiono na sekcje przez godzinę w 37 ° C. Po płukaniu biotynylowane drugorzędowe przeciwciała (BD Pharmingen, San Diego, Kalifornia, USA) nakładano przez godzinę, a następnie streptawidynę / peroksydazę chrzanową (BD Pharmingen) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie system detekcji diaminobenzydyny (Vector Laboratories Inc. , Burlingame, Kalifornia, USA) zgodnie z instrukcją producenta. Barwienie jądrowe przeprowadzono za pomocą hematoksyliny. Zastosowano następujące pierwszorzędowe przeciwciała: szczurzą przeciwciało anty-mysie Mac-3 przeciw mar- kofagom (BD Pharmingen), szczurzy anty-mysie mAb CD45RA przeciw limfocytom (BD Pharmingen) i szczurze przeciwciało anty-mysi y-6G (Gr-1) przeciwko neutrofilom (BD Pharmingen). Powierzchnię przekroju miocytu mierzono na podstawie zdjęć wykonanych z zabarwionych srebrem segmentów metakrylanowych o grubości 1-. M, jak opisano (22, 23, 25). Odpowiednie przekroje zdefiniowano jako mające prawie okrągłe profile kapilarne i sekcje miocytów o kształcie kołowym do owalnego. Nie dokonano korekty dla ukośnego cięcia. Zarys 100. 200 miocytów został zidentyfikowany w każdej sekcji. Do określenia powierzchni przekroju miocytów wykorzystano oprogramowanie systemu obrazu MetaMorph (Universal Imaging Corp., Downingtown, Pennsylvania, USA) (22, 23, 25). Ocena apoptozy. Fragmentację DNA wykrywano in situ za pomocą TUNEL, jak opisano (22, 23). W skrócie, odwarafinowane skrawki inkubowano z proteinazą K i fragmentami DNA znakowanymi sprzężoną z biotyną dUTP i terminalną transferazą deoksyrybonukleotydową i wizualizowano za pomocą FITC-ekstraktydyny (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Gęstość jądrową określono przez ręczne zliczenie jąder barwionych 4., 6-diamidyno-2P-fenyloindolem (zabarwionych DAPI) w sześciu polach każdego zwierzęcia przy użyciu celu x40 i policzono liczbę jąder TUNEL-dodatnich. poprzez zbadanie całej sekcji przy użyciu celu o tej samej mocy
[hasła pokrewne: olejowanie włosów kręconych, szczepionki na pneumokoki, termometr microlife instrukcja obsługi ]
[patrz też: 5lo bydgoszcz, hiperhomocysteinemia, artur puzio ]