Zwiększona ekspresja receptora C5a w sepsie cd

Neutrofile następnie wirowano i zawieszano w buforze wiążącym (HBSS, 0,1% BSA) w końcowym stężeniu 2 x 107 komórek / ml i inkubowano przez 20 minut z całym króliczym IgG (kontrola) lub a C5aR. Dwieście mikrolitrów zawiesin komórkowych inkubowano następnie w temperaturze 4 ° C przez 20 minut w obecności 125I-C5a (aktywność właściwa 30-30 ° C / kg). Następnie, zawiesinę komórkową nawarstwiono na 20% sacharozę i osadzono przez odwirowanie (11 000 g) w obracającym się wirniku kubełkowym przez 2 minuty. Po odwirowaniu probówki zamrożono w temperaturze <80 ° C, a końce (zawierające pastylki komórek) odcięto w celu określenia związanego z komórką 125I-C5a, z zastosowaniem licznika gamma (1261 Multi-A, Wallac Co.). Wyniki następnie wyrażono jako cpm, w funkcji stężenia 125I-C5a, w celu ustalenia krzywej nasycenia. Izolacja RNA i detekcja mRNA C5aR za pomocą półilościowego RT-PCR. Narządy z myszy otrzymano 0, 3, 6 i 12 godzin po indukcji CLP i przygotowano jak opisano powyżej. Całkowite RNA wyizolowano metodą Trizol (Life Technologies Inc., Rockville, Maryland, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Trawienie jakiegokolwiek zanieczyszczającego DNA uzyskano przez traktowanie próbek DNazą wolną od RN1 RQ1 (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA). Odwrotną transkrypcję przeprowadzono przy użyciu 5 | ig RNA przy użyciu Superscript II RNazy H. Odwrotna transkryptaza (GIBCO BRL, Life Technologies Inc., Grand Island, Nowy Jork, USA) zgodnie z protokołem producenta. Następnie przeprowadzono PCR ze starterami dla C5aR: 5. primer, 5 (3 -TAT AGT CCT GCC CTC GCT CAT-3 .; i 3. primer, 5 -TCA CCA CTT TGA GCG TCT TGG-3 .. Startery zaprojektowano do amplifikacji cDNA o wielkości 409 bp w środkowym regionie cDNA szczurzego C5aR (pozycje 373. 781). Startery do sprzątania . gen GAPDH wynosił: 5. primer, 5 (3-GCC TCG TCT CAT AGA CAA GAT G-3 .; i 3. primer, 5. -CAG TAG ACT CCA CGA CAT AC-3 .. Po gorącym początku . przez 5 minut w temperaturze 94 ° C, do amplifikacji użyto 35 cykli z temperaturą topnienia 94 ° C, temperaturą wyżarzania 60 ° C i temperaturą rozszerzania równą 72 ° C, każdą przez minutę, a następnie końcowym wydłużeniem w 72 ° C przez 8 minut. Produkt RT-PCR został potwierdzony przez elektroforezę próbek w 1,2% żelu agarozowym. Eksperymenty kontrolne przeprowadzono z próbkami; w tych eksperymentach powstrzymywaliśmy się od dodawania odwrotnej transkryptazy, aby wykluczyć zanieczyszczające DNA odpowiedzialne za jakiekolwiek wyniki. Przeprowadzono PCR stosując różne liczby cykli dla starterów C5aR i GAPDH, aby upewnić się, że DNA wykryto w liniowej części krzywych wzmacniających dla obu starterów. Wyniki przedstawiono w sposób półilościowy. Barwienie immunohistochemiczne dla C5aR. Narządy z myszy przepłukano i zebrano jak opisano powyżej w 0, 6 i 12 godzin po CLP i szybko zamrożono w ciekłym azocie. W płucach płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe wykonywano zgodnie ze wskazaniem, a płuca następnie napompowano 0,8 ml roztworu do osadzania tkanek (związek Tissue-Tek OCT, Fisher Scientific Co., Pittsburgh, Pensylwania, USA) przed zamrożeniem, aby zapobiec zapadnięciu pęcherzyków płucnych. Wycinki z sześciu mikrometrów płukano najpierw PBS przez 10 sekund, a następnie utrwalano w metanolu przez 6 minut. Następnie skrawki tkanek ponownie płukano w DPBS przez 30 sekund, a następnie inkubowano z IgAa5aR IgG w rozcieńczeniu 1: 100 roztworu podstawowego (0,5 mg / ml) w PBS przez 2 godziny. Następnie skrawki tkanki przepłukano przez 2 minuty DPBS przed inkubacją z rozcieńczonym 1: 500 kozim anty-króliczym IgG sprzężonym z peroksydazą przez 30 minut (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.). Po przemyciu PBS przez 2 minuty sekcje wybarwiono stosując zestaw do barwienia wektora AEC (Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, USA). Barwienie kontrastowe osiągnięto za pomocą hematoksyliny przez 30 sekund. Sekcje tkankowe zostały unieruchomione, a szkiełka nakrywkowe zamontowano za pomocą medium Permount (Fisher Scientific Co.). Barwienie udokumentowano za pomocą mikroskopii świetlnej i obrazowania cyfrowego. Wykrywanie IL-6 i TNF-a w surowicy myszy za pomocą testu ELISA. Krew pobierano od myszy, którym podawano C5aR i kontrolnej IgGy po 6 i 18 godzinach po CLP i pozwalano skrzepywać na lodzie przez 2 godziny przed uzyskaniem surowicy przez odwirowanie. Próbki surowicy były następnie analizowane pod kątem IL-6 i TNF-a. zawartość przy użyciu zestawów ELISA (BioSource International Inc., Camarillo, Kalifornia, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Liczba bakterii w narządach zwierząt CLP. Osiemnaście godzin po CLP wyizolowano płuca, wątrobę i nerki z myszy, którym wstrzyknięto C5aR i kontrolną IgGa.
[przypisy: śliwka w czekoladzie kalorie, paznokcie w dwóch kolorach, pogotowie stomatologiczne kielce ]
[przypisy: warsaw shore odcinek 3 kinomaniak, marcin nikrant, olga jahr ]