Normalna ludzka skóra właściwa zawiera wyraźne populacje komórek dendrytycznych CD11c + BDCA-1 + i makrofagów CD163 + FXIIIA + ad 6

Dla porównania, komórki CD163hi nie były immunostymulujące w allo-MLR, ani nie były indukowane jako pobudzające, chociaż mogą posiadać pewną zdolność prezentowania antygenu z regulacją w górę cząsteczek MHC klasy II (29). Tatuaże skórne stanowiły drugie badanie funkcjonalne: aktywność fagocytarną makrofagów tkankowych. Granulki pigmentu znaleziono w strukturach komórkowych podobnych do lizosomu, a komórki zawierające pigment barwiono równomiernie za pomocą CD163. W przeszłości badano los pigmentu tatuażowego wstrzykiwanego do tkanek skórnych, a fibroblasty uważano za główny długoterminowy rezerwuar granulatu pigmentu, z pigmentem od czasu do czasu makrofagami (30, 31). Jednak nasze dane sugerują, że makrofagi są istotnym składnikiem pigmentu skórnego. Komórki z pigmentem były CD163 + i BDCA-1 (3, były okrągłe, miały liczne projekcje mikrokrzelowe, a pigment był zawarty w strukturach związanych z błoną (lizosomy). Te cechy są zgodne z makrofagami (31, 32). Podsumowując, zidentyfikowaliśmy komórki CD11c + jako niedojrzałe szpikowe DC w prawidłowej skórze ludzkiej i komórki FXIIIA + jako makrofagi obecne w tkankach, a nie DC, ponieważ były wcześniej klasyfikowane. W przyszłych badaniach skórnych DC, zalecamy rozważenie zastosowania CD11c / BDCA-1 i CD163 jako alternatywnych markerów do identyfikacji odpowiednio DC i makrofagów skórnych, ponieważ są one bardziej specyficzne i bardziej użyteczne w zastosowaniach cytometrii przepływowej. Metody Próbki skóry. Biopsje skóry (o średnicy 6 mm) uzyskano od 15 zdrowych ochotników zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Review Board w Rockefeller University. Uzyskano świadomą zgodę. Biopsje zamrożono w OTC (Sakura) i przechowywano w temperaturze <80 ° C dla immunohistochemii i immunofluorescencji. Normalne próbki z abdominoplastyki były przetwarzane w ciągu 4 godzin po operacji. Te próbki do plastyki brzucha były również źródłem materiału do tatuowania (n = 2). Immunohistochemia. Normalne skrawki skóry (n = 15) wybarwiono oczyszczonym mysim przeciwciałem anty-ludzkim CD11c (rozcieńczonym 1: 100) i oczyszczonym z przeciwciał przeciw ludzkiemu FXIIIA (rozcieńczonym 1: 100, Enzyme Research Laboratories). Znakowane biotyną końskie przeciwciała anty-mysie i królicze przeciwciała anty-owcze znakowane biotyną (Vector Laboratories) zostały użyte do wykrywania odpowiednio przeciwciał CD11c i FXIIIA. Sygnał barwiący amplifikowano za pomocą kompleksu awidyna-biotyna (Vector Laboratories) i opracowano za pomocą chromogenu 3-amino-9-etylokarbazolu (Sigma-Aldrich). Liczbę dodatnich komórek na mm obliczono ręcznie przy użyciu komputerowej analizy obrazu (NIH Image 6.1; http://rsb.info.nih.gov/nih-image). Do barwienia immunologicznego FXIIIA badano kilka dodatkowych przeciwciał, w tym AC-1A1 (Labvision), E5014 (Spring Bioscience) i E980.1 (Biogeniex). Wybraliśmy przeciwciało oczyszczone przez powinowactwo owcy, ponieważ dało najbardziej specyficzne wybarwienie komórkowe z najmniejszym zabarwieniem naskórkowym. Przeciwciała. Wszystkie przeciwciała stosowane do immunofluorescencji i FACS prawidłowej tkanki wymieniono w Tabelach dodatkowych i 2. Immunofluorescencja. Normalne skrawki skóry (n = 6) utrwalono acetonem i zablokowano w 10% normalnej surowicy koziej (Vector Laboratories) przez 30 minut. Pierwotne przeciwciała CD11c i FXIIIA inkubowano przez noc w temperaturze 4 ° C i amplifikowano z odpowiednim przeciwciałem wtórnym: kozim anty-mysim IgG1 skoniugowanym z Alexa Fluor 488 lub 568, lub anty-owcem sprzężonym z Alexa Fluor 488 lub 568, odpowiednio. W celu kolokalizacji za pomocą CD11c lub FXIIIA przekroje następnie poddano koszerowaniu przez noc z drugim przeciwciałem, jak wyszczególniono w Tabeli dodatkowej i powielono z odpowiednim drugorzędowym przeciwciałem przeciw koziemu (Tabela dodatkowa 1). Obrazy uzyskano przy użyciu odpowiednich filtrów mikroskopu Zeiss Axioplan 2I z soczewką numeryczną Plan Apochromat 20 × 0,7 i chłodzoną ładunkiem Hagamatsu orca ER kamerą urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym, kontrolowaną przez oprogramowanie METAVUE (Universal Imaging). Skórne włókna kolagenowe dawały zieloną autofluorescencję. Przeciwciała skoniugowane z fluorochromem często dawały fluorescencję naskórkową w tle. Obrazy na każdej figurze przedstawiono jako jednobarwne plamy koloru zielonego i czerwonego, aby uwidocznić lokalizację 2 markerów na podobnych lub różnych komórkach. Scalone obrazy są wyświetlane pod plamami jednobarwnymi. Komórki, które koekstrują 2 znaczniki w podobnej lokalizacji, są często w kolorze żółtym. Mikroskopia elektronowa. Skórę utrwalono w 2,5% aldehydem glutarowym i poddano rutynowej elektronowej mikroskopii transmisyjnej. Skrawki plastyczne semitinowe zabarwiono błękitem toluidyny w celu oceny pod mikroskopem świetlnym [więcej w: empress, olejowanie włosów kręconych, joanna derybowska ] [patrz też: duduk, empress, kto poślubi mojego syna uczestnicy ]