Normalna ludzka skóra właściwa zawiera wyraźne populacje komórek dendrytycznych CD11c + BDCA-1 + i makrofagów CD163 + FXIIIA + ad 7

Sekcje ultracienki (65 nm) pocięto nożem diamentowym, zebrano na kratkach miedzianych i barwiono octanem uranu i cytrynianem ołowiu przed oglądaniem w elektronowym mikroskopie elektronowym Tecnaispirit (FEI Company) wyposażonym w kamerę z aparatem ze sprzężeniem ładunkowym Ultrascan 895 ( Gatan). Przetwarzanie próbki skóry. Skórne zawiesiny pojedynczych komórek z normalnej skóry uzyskano przy użyciu zmodyfikowanej metody kolagenazy / dyspazy (16). Podskórny tłuszcz wycięto, a pozostałą tkankę przemyto PBS. Warstwę skórną silnie nacięto skalpelem i inkubowano w mg / ml kolagenazy typu (Invitrogen), mg / ml dispazy (Invitrogen) i 1% roztworu penicyliny-streptomycyny (Sigma-Aldrich) przez noc w 37 ° C. Naskórek oderwano i odrzucono, a skórę właściwą przeniesiono do świeżego RPMI 1640 uzupełnionego 10% połączoną surowicą ludzką (Mediatech Inc.), 0,1% roztworem odczynnika gentamycyny (Invitrogen) i 1% 1M buforem HEPES (Sigma-Aldrich). ). Skórę właściwą inkubowano 24. 48 godzin w 37 ° C, a supernatant zebrano i przesączono za pomocą 40. M mikromacierzy komórkowych (BD Biosciences). Komórki następnie stosowano natychmiast (dla MLR; n = 3) lub zamrożono w RPMI 1640 (Invitrogen) i 10% DMSO (ATCC) dla FACS (n = 3). FACS. Komórki wybarwiono przeciwciałami wymienionymi w Tabeli 2. W skrócie, komórki wybarwiono na 20 minut w 4 ° C, przemyto za pomocą płukania FACS (PBS 0,1% azydek sodu i 2% FBS) i ponownie zawieszono w 1,3% formaldehydzie (Fisher Scientific) w FACSwash. W celu wykrycia DC-LAMP, komórki najpierw wybarwiono markerami powierzchniowymi, a następnie permeabilizowano (FacsPerm; BD) przed barwieniem wewnątrzkomórkowym. Próbki pobierano przy użyciu FACSCanto lub LSR-II (oba z BD Biosciences) i analizowano za pomocą FlowJo (Treestar). Zastosowano odpowiednie izotypy. FACS i MLR. Komórki skóry z zawiesin pojedynczych komórek zdrowej skóry barwiono przeciwciałem BDCA-1, CD19 i CD163 i sortowano na FACSAria (BD Biosciences) stosując ustawienie niskiego ciśnienia. Otrzymano dwie populacje: BDCA-1 + CD19. i CD163 +. Przeprowadzono zbiór po sortowaniu w celu potwierdzenia czystości każdej stymulującej populacji. W przypadku niektórych eksperymentów posortowane komórki hodowano przez 2 dni zi bez cytokin dla dojrzewających DC ex-vivo (IL-1 p, IL-6, TNF-a i PGE2), a następnie przemywano i przygotowywano do MLR. Odpowiadające komórki T uzyskano od normalnego ochotnika za pomocą wirowania w gęstości ponad Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences), a następnie oczyszczono komórki T przy użyciu zestawu do selekcji negatywnej pod względem komórek T (Dynal). Komórki T wyznakowano 10 | jm CFSE i hodowano wspólnie z sortowanymi komórkami BDCA-1 + lub CD163 + w stosunku 1:10, 1:50 i 1: 100 (w zależności od wydajności komórek). Komórki T bez populacji stymulatorów zastosowano jako kontrolę ujemną, a dojrzałe DC pochodzące od monocytów dodano do komórek T jako kontrolę pozytywną. Proces wytwarzania dojrzałych DC został wcześniej opisany (33). Proliferację komórek T analizowano w dniu 8 po sortowaniu. Hodowle zebrano, barwiono 250 ng / ml jodku propidyny (PI) w celu oznaczenia martwych komórek i CD3-APC (BD) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Komórki PI-ujemne bramkowano, a następnie nanoszono na komórki CFSE versus CD3 +, gdzie komórki proliferujące rozcieńczały swoją zawartość CFSE i przemieszczały się na lewo od nieproliferujących komórek. Niskie komórki CFSE oznaczono ilościowo jako procent żywych komórek w hodowli (34). Statystyka. Do porównania komórek CD11c i FXIIIA + w prawidłowych skrawkach skóry użyto testu dwustronnego z dwoma ogonami. Wyniki przedstawiono jako średnie. SEM. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za znaczącą. Materiały uzupełniające Zobacz Dodatkowe dane Podziękowania Niniejsze badanie zostało wsparte dotacjami NIH R01 AI-49572, AI-49832, UL1 RR024143 i AI40045 (RM Steinman). MA Lowes jest wspierany przez grant NIH K23 AR052404-01A1, a L. Zaba jest obsługiwany przez grant NIH MSTP GM07739. Dziękujemy chirurgom plastycznym AN LaBruna i DM Senderoff za hojną darowiznę chirurgicznych odpadów abdominoplastycznych, H. Shio i A. Khatcherian za pomoc techniczną w zakresie mikroskopii elektronowej i immunohistochemii tatuażu, oraz A. Piperno za miły dar monoklonalny przeciwciało DEC-205 / CD205. Doceniamy również pomoc i doradztwo w zakresie metody Flow Cytometry Core Facility (S. Mazel) oraz Centrum Zasobów Bioobrazowych (A. North) na Uniwersytecie Rockefellera. Dziękujemy Patricii Gilleaudea i Mary Whalen-Sullivan za doskonałą opiekę nad naszymi pacjentami. Przypisy Niestandardowe skróty: BDCA, antygen krwi DC; DC-LAMP, glikoproteina błonowa związana z DC-lizosomalnie; DC-SIGN, specyficzny dla DC nie integrujący ICAM-3 .; FACS, sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjnie; FXIIIA, czynnik XIIIA; LC, komórka Langerhansa; MFI, mediana intensywności fluorescencji; MLR, mieszana reakcja leukocytów; MMR, receptor mannozowy makrofagów; PDC, plazmacytoid DC. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin. Invest.117: 2517. 2525 (2007). doi: 10.1172 / JCI32282 Zobacz powiązany artykuł na Pogłębianie naszej wiedzy na temat immunologicznych wskaźników w skórze.
[podobne: jacek rybacki, trojanek, paznokcie w dwóch kolorach ]
[hasła pokrewne: wypadanie płatka zastawki mitralnej, jacek bryndal, klaudia el dursi ]