Toksyna VacA Helicobacter pylori jest permeazą mocznika, która promuje dyfuzję mocznika w nabłonku ad 6

Wartości są wyrażone jako procent efektu indukowanego przez VacA w monowarstwie komórkowym przy braku floretyny i stanowią średnią z trzech eksperymentów prowadzonych w dwóch powtórzeniach. SE. Dane te zdecydowanie sugerują, że floreina bezpośrednio wchodzi w interakcję z toksyną. Aby przetestować tę możliwość, jej wpływ na kanał anionowy VacA został oceniony w planarnych eksperymentach z dwuwarstwowymi lipidami. Figura 7a pokazuje, że flore toryna zahamowała indukowany przez VacA prąd jonowy o IC50 około 15 | jM. Zawierał również tiomocznik (Figura 7b) i pCMBS (dane nie pokazane), dwie inne cząsteczki, o których wiadomo, że wpływają na pasywne transportery mocznika (32. 34). Tiomocznik (400 mM) wyznaczył 30% (trans) lub 45% (cis) zahamowanie przewodzenia jonów przez kanały VacA w planarnych dwuwarstwach lipidowych, w zależności od strony addycji. Mocznik (400 mM) dawał słabsze 5% hamowania. Konsekwentnie, 400 mM tiomocznika hamowało indukowaną VacA dyfuzję mocznika [14C] przez monowarstwy MDCK II o 70%, podczas gdy 400 mM mocznik był nieskuteczny. pCMBS (do 250 .M) nie wykazywał żadnego działania w żadnym z testów. Figura 7 Wpływ floretyny, tiomocznika i mocznika na strumień przezbłonowy i przeznabłonkowy [14C] strumień mocznika indukowany przez VacA. (a) Aktywowaną (pH 2,0) VacA (2. 4 nM) dodano do planarnych membran bifenylo-fosfatydylocholiny, a prąd transbłonowy mierzono przed i po dodawaniu wzrastających stężeń floretaminy do strony cis. Pozostały prąd jest podawany jako procent wartości początkowej. Vcis: 40 mV. Każdy punkt reprezentuje średnią z trzech do sześciu eksperymentów. SE. Zmodyfikowana izoterma Langmuira (38) została użyta do dopasowania; KD = 15. 1. M. Inset: Wpływ 50 .M floretyny na indukowany VacA prąd transbłonowy po dodaniu do kolumny cis (wypełniona kolumna; n = 5) lub trans (kolumna otwarta; n = 6). (b) Hamowanie prądu przewodzonego przez VacA przez dodanie 400 mM tiomocznika lub 400 mM mocznika do cis (wypełniona kolumna, n = 4) lub do strony trans (otwarta kolumna, n = 4) membrany. Szare kolumny reprezentują hamujący wpływ tiomocznika i mocznika na wzrost przeznabłonkowej dyfuzji mocznika [14C] przez spolaryzowane monowarstwy komórek MDCK II, określone po 3-godzinnym zatruciu przez 125 nM VacA. Dane wyrażono jako procent hamowania w odniesieniu do kontroli pod nieobecność zimnego tiomocznika i mocznika i czy średnia z trzech eksperymentów prowadzona jest w dwóch powtórzeniach. SE. Dyskusja Chociaż ostatnie dane wskazują, że H. pylori przekazuje częściowo cytotoksynę VacA do skutecznej kolonizacji żołądka (17), brakuje wyraźnego związku pomiędzy toksycznymi efektami biologicznymi in vitro i ich rolą in vivo. Przedstawione tu dane sugerują, że in vivo działanie VacA polega na zwiększeniu dyfuzji mocznika z tkanki podśluzówkowej w kierunku światła żołądka. W rzeczywistości bariera nabłonkowa do dyfuzji mocznika jest selektywnie zmniejszana przez VacA poprzez generowanie pasywnego, nienasyconego układu transportowego. Działanie to nie jest związane ze spadkiem oporności szlaku okołokomórkowego i jest obserwowane nie tylko w nabłonkach o wysokiej oporności, takich jak monowarstwy MDCK I, ale także w tych o niskiej oporności, takich jak monowarstwy CaCo2 i MDCK II. Dane te pośrednio sugerują, że po zatruciu VacA wzrasta przepływ mikrokomórkowy mocznika. Eksperymenty prowadzone z niespolaryzowanymi komórkami rzeczywiście wskazują, że VacA przepuszcza błony komórkowe w komórce do mocznika z nieznaczną nieswoistą zmianą błony, ponieważ dyfuzja innych neutralnych cząsteczek, takich jak znacznie mniej wpływa. Szybki początek działania, niezgodny z szybkością endocytozy toksyny (24) i brak hamowania przez blok endocytozy, wskazują, że VacA działa bezpośrednio na błonę plazmatyczną. Chociaż nie można wykluczyć, że w spolaryzowanych komórkach nabłonka błonę podstawno-boczną jest również permeabilizowana przez VacA, każdy taki efekt może być nieistotny. Jest tak dlatego, że jest to szczytowa domena membrany, która stawia najwyższą odporność na przepływ małych nieelektrolitów (26, 35), ze względu na zewnętrzną emi-ulotkę szczególnie wzbogaconą w cholesterol, sfingomielinę i glikosfingolipidy (26. 28, 35, 36 ). W komórkach MDCK oszacowano, że wewnętrzna oporność na mocznik apiklidii w okolicy wierzchołkowej jest około 50 razy większa niż w przypadku emulgatora cytozolowego i jest znacznie większa niż w przypadku błony podstawno-bocznej (28). Oznacza to, że permeabilizacja tej warstwy lipidowej przez VacA jest konieczna i wystarczająca do zwiększenia przepływu mocznika przez cały nabłonek. Teoretycznie VacA może przeniknąć membranę plazmy do mocznika, aktywując endogenny transporter mocznika. Alternatywnie, biorąc pod uwagę, że aktywowane VacA inserty o niskiej wartości pH do dwuwarstwy lipidowej tworzą pory transbłonowe (17, 18, 20), sam VacA może działać jako pasywny przenośnik mocznika
[hasła pokrewne: paznokcie w dwóch kolorach, śliwka w czekoladzie kalorie, jaka sukienka na ślub cywilny ]
[przypisy: jacek bryndal, klaudia el dursi, 5lo bydgoszcz ]