TGF-dependent zależna patogeneza wypadania płatka zastawki mitralnej w mysim modelu zespołu Marfana ad 6

Skrawki tkanki przygotowano jak powyżej i wybarwiono hematoksyliną i eozyną. Zawory zastawki mitralnej zbadano przy powiększeniu x20 i porównano ze standardem kalibracji 50. L zawartym w każdym obrazie. Długość zastawki mitralnej określono przez badanie odcinków seryjnych i przez pomiar odległości wzdłuż środka ulotki od początku zaworu do końcówki ulotki. Grubość zastawki mitralnej zmierzono w najgrubszym punkcie prostopadłym do osi długości płatka. W analizach uwzględniono jedynie sekcje, w których można było zobaczyć całą ulotkę. Dane morfometryczne od myszy o tym samym genotypie w danym wieku zostały połączone i wykorzystane do wygenerowania 95% przedziałów ufności. Do oceny istotności statystycznej użyto testu ucznia. Badanie echokardiograficzne przeprowadzono za pomocą systemu obrazowania Visualsonics Vevo 660 V1.3.6 i przetwornika 35 MHz (model Visualsonics RMV603). Zwierzęta poddano sedacji za pomocą inhalacji 1% izofluranu (Sigma-Aldrich), a częstości akcji serca utrzymywano na poziomie 500 550 550 uderzeń na minutę. Leczenie przeciwciałami neutralizującymi TGF-a. Heterozygoty płci żeńskiej, które były w ciąży od momentu skojarzenia z heterozygotami płci męskiej, otrzymały dootrzewnowe wstrzyknięcie przeciwciała neutralizującego TGF-a (R & D Systems) na E14.5 i E17.5. Przeciwciało rozcieńczono w PBS (pH 7,4) do stężenia mg / ml i wstrzyknięto w dawce 10 mg / kg masy ciała. Królicze IgG (10 mg / kg; Zymed Laboratories Inc.) podawano w podobny sposób jak kontrolę. Do analizy morfometrycznej wykorzystaliśmy co najmniej 6 myszy na genotyp. Przygotowanie RNA. W celu ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym i analizy mikromacierzy, serca usunięto z eutanazowanych myszy przy P6,5 i natychmiast zanurzono w RNALater (QIAGEN Inc.). Obie ulotki zastawki mitralnej zostały wycięte w RNALater i przechowywane w temperaturze ~ 80 ° C w Trizol (Invitrogen Corp.) do momentu określenia genotypów. Osiem zaworów dla każdego genotypu połączono i homogenizowano stosując lizę strzykawki. Ekstrakcję RNA przeprowadzono zgodnie ze standardowym protokołem Trizol, stosując 10 .g nośnika glikogenu. Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym. C-RNA pierwszej nici syntetyzowano przy użyciu systemu SuperScript First-Strand Synthesis dla zestawu RT-PCR (Invitrogen Corp.). Gdy było to możliwe, użyto gotowych primerów Assays on Demand (Applied Biosystems) i Taqman (Applied Biosystems). Zarówno Testy na żądanie jak i własne startery zaprojektowano tak, aby obejmowały introny zapobiegające wykrywaniu zanieczyszczeń genomowego DNA. Eksperymenty Singleplex, z próbkami prowadzonymi w trzech powtórzeniach, przeprowadzono w systemie MJ Research Opticon (MJ Research). Względne oznaczanie ilościowe przy użyciu metody krzywej standardowej zastosowano do porównania ekspresji genów między genotypami. Próbki bez cDNA i próbki zawierające RNA, ale pozbawione odwrotnej transkryptazy były prowadzone jako kontrole dla każdego badanego genu. Do kontroli błędu załadowania włączono gen mikrobiologiczny genu -2-housekeeping. Wartości P uzyskano przy użyciu analiz ANOVA z 2 czynnikami (genotyp i zmienność przebiegu) w modelu addytywnym. Profilowanie ekspresji za pomocą mikromacierzy DNA. Cztery próbki RNA pochodzące z mysich zastawek mitralnych zostały przedłożone do analizy mikromacierzy (1 Fbn1 + / +, 2 Fbn1C1039G / + i Fbn1C1039G / C1039G). Próbki przetwarzano stosując 2-okrągły protokół amplifikacji RNA opisany przez Affymetrix (Affymetrix GeneChip Eukaryotic Small Sample Target Labelling Assay Version II; http://www.affymetrix.com/support/technical/technotes/smallv2_technote.pdf). W skrócie, 100 ng wyjściowego całkowitego RNA zastosowano do syntezy cDNA pierwszej nici przy użyciu sond oligonukleotydowych z 24 oligo-dT plus promotor T7 jako primer (Proligo LLC) i SuperScript Choice System (Invitrogen Corp.). Po dwuniciowej syntezie cDNA, produkt oczyszczono przez ekstrakcję fenol-chloroform, a nieznakowane rybonukleotydy zastosowano w pierwszej rundzie amplifikacji cRNA transkrypcji in vitro (Mega-skrypt, Ambion). Kolejny cykl syntezy cDNA rozpoczęto od losowych starterów, a oligo-dT z promotorem T7 ponownie zastosowano jako primer dla etapu syntezy drugiej nici cDNA. Dwuniciowy produkt cDNA następnie oczyszczono ponownie za pomocą ekstrakcji fenol-chloroform. Biotynylowane antysensowne cRNA wytworzono następnie przez transkrypcję in vitro przy użyciu zestawu BioArray RNA HighYield Transcript Labelling (ENZO Life Sciences Inc). Następnie 15 ug biotynylowanego wyznakowanego cRNA fragmentowano w 94 ° C przez 35 minut (100 mM octan trixu, pH 8,2, 500 mM KOAc, 150 mM MgOAC) i 10 ug całkowitego fragmentowanego cRNA hybrydyzowano do Gen mysi Affymetrix GeneChip Macierz MOE430A przez 16 godzin w 45 ° C ze stałą rotacją. Substancję Affymetrix Fluidics Station 400 użyto następnie do przemycia i wybarwienia chipsów, usunięcia niezhybrydyzowanego celu i inkubacji z koniugatem streptawidyna-fikoerytryna w celu wybarwienia biotynylowanego cRNA
[więcej w: benzoesan sodu szkodliwość, joanna derybowska, maciej syka ]
[więcej w: olga jahr, śliwka w czekoladzie kalorie, trojanek ]