Leptyna chroni myszy przed atrofią limfatyczną wywołaną głodem i zwiększa komórkę grasicy u myszy ob / ob ad

Myszy składały się z 3 grup (n = 8 na grupę). Jedna grupa miała dostęp ad libitum do karmy laboratoryjnej i otrzymywała dootrzewnowe iniekcje 0,2 ml PBS o godzinie 09:00 i 1800 godzin dwa razy dziennie przez 2 dni. Dwie grupy myszy pozbawiono karmy przez 48 godzin i otrzymywano dootrzewnowe iniekcje 0,2 ml PBS lub rekombinowanej leptyny myszy (1 ug / g początkowej masy ciała) o 09:00 i 1800 godzinach. Wszystkie myszy miały stały dostęp do wody. Wykazano, że ten eksperymentalny paradygmat podawania leptyny podczas głodowania osiąga stężenie leptyny we krwi 6 i 12 godzin po wstrzyknięciu, podobne do kontrolnych myszy karmionych ad libitum a i uznano go za terapię zastępczą (4, 7, 23). Pod koniec 48 godzin myszy uśmiercono przez inhalację CO2 i krew zebrano przez ostateczne nakłucie serca między 0900 i 1000 godzin i natychmiast odwirowano; osocze oddzielono i przechowywano w temperaturze ~ 20 ° C aż do oznaczenia glukozy, insuliny i kortykosteronu. Myszy ob / ob. Myszy składały się z 3 grup (n = 6 na grupę). Jednej grupie pozwolono na karmienie ad libitum, drugiej grupie wstrzyknięto rekombinowaną mysią leptynę (1 ug / g początkowej masy ciała dwa razy dziennie dootrzewnowo), a trzecią grupę podano paszy do przyjmowania pokarmu myszy leczonych leptyną i otrzymywały iniekcje PBS dwa razy dziennie. Wszystkie myszy ważono, a ich dzienne spożycie było rejestrowane. Rankiem po 10 dniach podawania leptyny myszy uśmiercono i pobrano krew jak powyżej. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych. Testy. Glukozę mierzono metodą oksydazy glukozy (analizator glukozy YSI 2300 Stat Plus, Yellow Springs Instrument Co. Yellow Springs, Ohio, USA). Insulinę w osoczu mierzono za pomocą RIA, jak opisano wcześniej (30). Stężenie kortykosteronu w osoczu mierzono za pomocą dostępnego w handlu RIA (ICN Biomedicals Inc. Costa Mesa, Kalifornia, USA). Ciężar / komórka organu. Narządy usunięto z uśmierconych myszy, a wagi wątroby i nerek oznaczono z dokładnością do 0,01 g. Śledziony usunięto i zważono z dokładnością do 0,1 mg. Zawiesinę pojedynczych komórek splenocytów przygotowano przy użyciu tępego końca strzykawki i przepuszczono zawiesinę przez gazę z nylonu. Czerwone krwinki poddano lizie buforem lizującym z chlorku amonu. Wszystkie tkanki grasicy ostrożnie usunięto przy użyciu cienkich kleszczyków po ekspozycji jamy klatki piersiowej i zważono z dokładnością do 0,1 mg. Masa grasicy nie została określona na myszach ob / ob, ponieważ nie było możliwe całkowite wycięcie tego narządu z otaczającej tkanki łącznej. Zawiesinę tymocytów w pojedynczej komórce wytworzono przez drażnienie komórek jajowych sterylnymi igłami na szalce Petriego. Czerwone krwinki poddano lizie buforem lizującym z chlorku amonu. Liczby splenocytów i tymocytów oznaczano przez zliczanie komórek 3 razy z różnych obszarów hemocytometru i obliczanie średniej liczby komórek. Subpopulacje komórek analizowano za pomocą dwukolorowej cytometrii przepływowej przy użyciu FACScalibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, California, USA) z odpowiednimi skoniugowanymi z FITC lub fikoerytryną mAb (anty-CD4, anty-CD8, PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA). Histologia. Ostry eksperyment głodowy powtórzono stosując powyższy protokół w dopasowanych wiekowo myszach. Z tej okazji usunięto nienaruszone grasicy, utrwalono w formalinie, zatopiono w parafinie, podzielono i zabarwiono hematoksyliną i eozyną (H & E) w celu oceny histologicznej architektury grasicy. Eksperymenty apoptozy. Apoptozę komórek tymocytów oznaczano metodą cytometrii przepływowej wiązania aneksyny-V z tymocytami wybarwionymi kontrastowo jodkiem propidyny (PI). Aneksyna V jest zależnym od wapnia białkiem wiążącym fosfolipidy o wysokim powinowactwie do fosfatydyloseryny. Ta cząsteczka jest zwykle obecna w wewnętrznej dwuwarstwie lipidowej, ale zostaje odsłonięta na powierzchni komórki w ciągu pierwszych kilku godzin od rozpoczęcia apoptozy (31). PI jest czerwonym barwnikiem wiążącym DNA, który może wejść tylko do komórek, których błony są zakłócone. Wpływ podawania leptyny in vivo na przeżycie tymocytów określono przez porównanie poziomu apoptozy w tymocytach świeżo pobranych od myszy ob / ob, traktowanych przewlekle leptyną (jak opisano powyżej), z poziomem świeżo zebranych tymocytów z karmienia parą i ad libitum. karmione myszy ob / ob i typu dzikiego (n = 6 na grupę). Aby zbadać, czy leptyna ma bezpośredni wpływ antyapoptotyczny na tymocyty, określiliśmy wpływ leptyny na indukowaną deksametazonem apoptozę tymocytów in vitro. Rozpuszczalny w wodzie deksametazon (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) zastosowano w końcowym stężeniu 10. 7 M
[podobne: trojanek, przechowywanie kosmetyków, maciej zagłoba zygler ]
[patrz też: empress, kto poślubi mojego syna uczestnicy, wypadanie płatka zastawki mitralnej ]