Matrix – zależne od metaloproteinazy-7 Uwalnianie czynnika martwicy nowotworu w modelu przepukliny dyski przepuklinowej ad

System współrodkowy krążka międzykręgowego / otrzewnej makrofagów został opisany wcześniej (13). Pokrótce, aktywowane mysie makrofagi otrzymano przez dootrzewnowe podawanie 3% pożywki tioglikolanowej (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA). W przypadku niektórych eksperymentów, czerwone fluorescencyjne linkery komórkowe (PKH26, Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, USA) wstrzyknięto do otrzewnej 3 dni po podaniu tioglikolanu zgodnie z instrukcjami producenta. Komórki zebrano przez płukanie otrzewnej 4 dni po traktowaniu tioglikolanem. Mózgowe krążki międzykręgowe uzyskano za pomocą mikroskopu po usunięciu skóry i miękkich tkanek. Całe tkanki krążka międzykręgowego (5 krążków / naczynie 35 mm) i makrofagi otrzewnowe (106 / ml) hodowano wspólnie w 5 ml Opti-MEM (GIBCO BRL, Grand Island, Nowy Jork, USA) zawierającym 50 ug / ml gentamycyny i 0,25 .g / ml Fungizone (GIBCO BRL) przez 2 dni w wilgotnym środowisku 5% CO2 w 37 ° C. W przypadku niektórych eksperymentów rekombinowany mysi TNF-a (R & D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), MMP-7 (1 ng / ml, Chemicon International, Temecula, Kalifornia, USA), kozie anty-mysie TNF-a. (1 ng / ml; R & D Systems), anty-mysia IL-1. (2 .g / ml, systemy R & D) lub kontrolne kozie IgG (1 ng / ml; Sigma) dodano do pożywki hodowlanej. Pożywki dla hodowli ryb oczyszczono przez odwirowanie i przetworzono w celu oznaczenia MMP-3 lub TNF-a. białko. Tkankę zatopiono w związku OCT, szybko zamrażano i badano 6-. M kriosekcję za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. W celu ilościowego oznaczenia degradacji tkanki tarczowej, krążki międzykręgowe (1 krążek na studzienkę 24-studzienkowej płytki do hodowli tkankowej, Corning-Costar, Cambridge, Massachusetts, USA) hodowano z lub bez makrofagów otrzewnowych (106 / ml) przez 3 dni w ml Opti-MEM z 50 .g / ml gentamycyny i 0,25 .g / ml Fungizone (GIBCO BRL). Przed i po zakończeniu inkubacji próbki usuwano z pożywki hodowlanej, krótko poklepywano sterylną gazą w celu usunięcia wody powierzchniowej, a ich wilgotną masę mierzono za pomocą automatycznej regulacji (CAHN 28, automatyczny pomiar oporu elektrycznego, CAHN Instrument Co., Paramount, Kalifornia, USA). ). Następnie próbki utrwalono w 4% paraformaldehydzie, zatopiono w parafinie i skrawki zabarwiono 0,25% safraniną O jako wskaźnikiem zawartości proteoglikanów w skrawkach tkanek (16). Western blotting. Po 2 dniach w hodowli, pozbawione surowicy kondycjonowane pożywki zebrano z pojedynczych hodowli i współhodowli, a całkowite białko oznaczono ilościowo przy użyciu testów Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA). Pożywki komórkowe rozcieńczono 1: buforem do próbek Laemmli. Białko (22,5 .g) z każdej próbki poddano SDS-PAGE (10 lub 15% żelu) w warunkach redukujących, a białka przeniesiono na membrany nitrocelulozowe (Nitro ME, MSI, Westborough, Massachusetts, USA). Membrany blokowano 5% beztłuszczowym mlekiem w roztworze soli buforowanym Tris (TBS, 0,15 M NaCl, 0,01 M Tris, pH 8,0) zawierającym 0,05% Tween-20 (TBS-T) przez godzinę, a następnie inkubowano z 1: 5000 rozcieńczenia przeciwciała anty-MMP-3 (17). Rekombinowany szczurzy MMP-3 zastosowano jako kontrolę pozytywną (17). Membrany następnie przemyto TBS-T i inkubowano sekwencyjnie z biotynylowaną przeciwciałem przeciw mysiej IgG (Vector Laboratories, Burlingame, California, USA) przez godzinę, ponownie przemyto i inkubowano ze streptawidyną sprzężoną z peroksydazą (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove , Pensylwania, USA) na godzinę. Immunoreaktywne białka zidentyfikowano przez chemiluminescencję za pomocą roztworu 2,5 mM luminolu (Sigma), 0,4 mM kwasu p-kumarowego (Sigma) i H2O2 w 50 mM TRIS (pH 6,5). Test migracji. Aktywność migracji makrofagów otrzewnowych badano za pomocą zmodyfikowanej komory Boydena, jak opisano wcześniej (13). Makrofagi (1,2 x 106 komórek / ml) zawieszono w pozbawionym surowicy DMEM zawierającym 200 ug / ml BSA lub Opti-MEM i dodano do górnych studzienek. DMEM z 10% FBS, 200 mg / ml BSA lub kondycjonowaną pożywką pochodzącą z makrofagów i tkanką dyskową dodano do niższej komory, jak wskazano. Po inkubacji przez 5 godzin w 37 ° C, policzono liczbę komórek w 6 polach dużej mocy (x 400) migrujących przez 8-.m pory. Analizę statystyczną danych przeprowadzono za pomocą testu Manna-Whitneya. Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za znaczącą. Kwantyfikacja TNF-a. Rozpuszczalny TNF-a mierzono w supernatantach z hodowli komórkowej za pomocą testu kanapkowego ELISA i specyficznego mysiego TNF-a. przeciwciała (systemy R & D). Dla niektórych eksperymentów jako próbki zastosowano 2-godzinną kondycjonowaną pożywkę z makrofagów, które traktowano 0 lub 100 ng / ml rMMP-7 w obecności lub nieobecności 10 ug / ml cykloheksimidu (Sigma).
[podobne: młody jęczmień w proszku, ciśnieniomierz elektroniczny, wypadanie płatka zastawki mitralnej ]
[przypisy: kto poślubi mojego syna uczestnicy, wypadanie płatka zastawki mitralnej, jacek bryndal ]