Systemowo wyprowadzone komórki jelita grubego CD4 + Th2 odgrywają centralną rolę w alergicznej biegunki z udziałem STAT6 ad

Bez względu na to, czy prowokowano raz lub dwukrotnie, u myszy otrzymujących 50 mg lub 100 mg doustnej OVA wystąpiła biegunka. Dlatego w tym badaniu wybraliśmy protokół jednej dawki podskórnego primingu z mg OVA przed karmieniem doustnym 50 mg OVA. W celu kontroli myszy wielokrotnie podawano 50 mg OVA w PBS przez intubację żołądka bez żadnego ogólnoustrojowego testu prowokacji. Dwie godziny po ostatnim podaniu doustnym myszy uśmiercono i analizowano reakcje alergiczne wywołane przez Ag. Leczenie mAb anty-IL-4. Leczenie Ab w warunkach in vivo przeprowadzono z użyciem standardowego protokołu, jak opisano wcześniej (14). Myszom BALB / c wstrzyknięto dootrzewnowo mAb anty-mysie IL-4 (BVD4-1D11, mg / mysz) lub kontrolne pod względem izotypu IgG2b szczurzej mAb (R35-38, mg / mysz) w 250 ul PBS raz tydzień na czas trwania eksperymentu. Leczenie Ab rozpoczęto tydzień przed układowym primingiem z OVA w CFA. Eksperyment transferu adopcyjnego. Ponieważ komórki GFP + są uważane za najbardziej odpowiedni system do eksperymentów z adoptywnym transferem, mających na celu zajęcie się wzorcami migracji określonego podzbioru komórek, myszy GFP Tg zostały wykorzystane jako nasze dawca w naszym badaniu (13). Myszy GFP Tg z tłem BALB / c immunizowano drogą podskórną mg OVA w CFA, jak już tu opisano. Komórki GFP + CD4 + T z oddzielonymi FACS (1 x 105 do 2 x 105) zawieszono ponownie w 200 ul PBS i przeniesiono adoptywnie na myszy SCID o podłożu BALB / c za pomocą wstrzyknięcia do żyły ogonowej. Tydzień po rekonstytucji myszy SCID-biorców wielokrotnie prowokowano 50 mg OVA przez intubację żołądka, jak już opisano tutaj. Ocena histologiczna. W badaniu histopatologicznym, małe i duże jelita myszy w każdej grupie utrwalono w 4% paraformaldehydzie i zatopiono w parafinie. Tkanki pocięto na sekcje o długości 5 urn i wybarwiono hematoksyliną i eozyną (H & E) w celu oceny ogólnych zmian patologicznych i odpowiednio barwnikiem błękitem Alcian i safraniną do analizy komórek tucznych. W celu wykrycia komórek GFP + tkanki utrwalono w 4% paraformaldehydzie i szybko zamrożono w podłożu do osadzania OCT (Sakura Finetechnical Co., Ltd., Tokio, Japonia). Kriostaty (7 .m) przygotowano i analizowano pod mikroskopem konfokalnym (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA). Immunohistochemiczne wykrywanie IgE. Świeżo uzyskane małe i duże jelita szybko zamrożono w pożywce OCT i przechowywano w temperaturze ~ 80 ° C aż do przetworzenia. Kriostaty (7 .m) przygotowano i barwiono mAbami FITC-anty-IgE (R35-118, PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA) przez noc w 4 ° C. Pozytywne komórki do barwienia mAb swoistymi dla IgE analizowano pod mikroskopem konfokalnym. ELISA dla całkowitego i swoistych wobec OVA IgEA w surowicy. W celu wykrycia całkowitych poziomów swoistych dla OVA IgE w surowicach, płytki immunologiczne (Nalge Nunc International, Naperville, Illinois, USA) opłaszczono oczyszczonym szczurzym mAb przeciw mysiemu IgE (R35-72, PharMingen) i inkubowano przez noc w 4 ° C jak opisano wcześniej (15). Po zablokowaniu 3% BSA w PBS, dodano seryjne rozcieńczenia próbek surowicy i standardowe mysie IgE (27-74, PharMingen) i inkubowano przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Po intensywnym przemyciu dodano biotynylowane szczurzą przeciwmysie mysie IgE mAb (R35-118, PharMingen) dla całkowitego IgE Ab lub biotynylowanego OVA dla specyficznego dla OVA IgE Ab. Płytki inkubowano przez noc w 4 ° C, znakowane peroksydazą mAb antybiotyny (Vector Laboratories, Burlingame, California, USA) dla całkowitej IgE lub 10 ng / ml streptawidyny AquaLite (SeaLite Sciences, Notcross, Szwecja) w 2 mM EGTA w PBS dla Dodano IgE swoiste dla OVA, odpowiednio. Po przemyciu reakcję barwy opracowano za pomocą 3, 3a, 5, 5-tetrametylobenzydyny (TMB, Moss Inc., Pasadena, Kalifornia, USA) dla całkowitej IgE. Tworzenie światła dla swoistych dla OVA IgE przeprowadzono w luminometrze (iEMS Reader, Labsystems Inc., Helsinki, Finlandia) przez wstrzyknięcie buforu Ca2 + (50 mM Tris, 20 mM CaAc [pH 7,5]) (16). Miano końcowych IgE specyficznych dla OVA wyrażono jako odwrotne log2 ostatniego rozcieńczenia, które wykazało poziom jednostek luminometrycznych dwukrotnie wyższy niż tło. W żadnym przypadku nieimmunizowane myszy nie dawały miana większego niż log2 z 2. Izolacja komórek jednojądrzastych. Śledzionę usunięto w warunkach aseptycznych i przygotowano zawiesiny pojedynczych komórek metodą mechanicznej dysocjacji, jak opisano poprzednio (17). Ponadto komórki jednojądrzaste oddzieliły się od małych i dużych jelit za pomocą kolagenazy (Typ IV, Sigma Chemical Co, 0,5 mg / ml RPMI 1640) po usunięciu plastrów Peyer a i plastrów okrężnicy (18). Zawiesiny pojedynczych komórek następnie połączono i dalej oczyszczono przy użyciu nieciągłego gradientu Percoll (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Szwecja), jak opisano uprzednio (17, 18). Test immunosorpcyjny związany z enzymem
[patrz też: joanna derybowska, jaka sukienka na ślub cywilny, ciśnieniomierz elektroniczny ]
[podobne: wypadanie płatka zastawki mitralnej, jacek bryndal, klaudia el dursi ]