Systemowo wyprowadzone komórki jelita grubego CD4 + Th2 odgrywają centralną rolę w alergicznej biegunki z udziałem STAT6 cd

W celu wykrycia specyficznych dla OVA komórek tworzących Ab (AFC) w śledzionie, jak również w jelicie cienkim i grubym, jak opisano wcześniej, przyjęto enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISPOT) (19). Analiza cytokin. Poziomy cytokin (w tym IFN-a, IL-4 i IL-5) supernatantów hodowli stymulowanych przez Ag jednojądrzastych komórek wyizolowanych ze śledziony oraz z jelita cienkiego i grubego zmierzono za pomocą testu ELISA, jak opisano wcześniej (20). Do testu IL-13 zestaw ELISA zakupiono od R & D Systems Inc. (Minneapolis, Minnesota, USA). Analiza FACS i sortowanie komórek. Sprzężone z PE przeciwciało anty-CD4 (RM4-5) z PharMingen stosowano w analizie cytometrii przepływowej przy użyciu FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, California, USA). W niektórych doświadczeniach separację sortowania cytometrii przepływowej przeprowadzano za pomocą FACS Vantage (Becton Dickinson) przy użyciu skoniugowanego z FITC anty-TCR i skoniugowane z PE mAb anty-CD4. Ilościowa metoda RT-PCR. Całkowity RNA wyekstrahowano za pomocą odczynnika TRIzol (Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, USA) i 5 ug / ml wyekstrahowanego RNA poddano reakcji RT, stosując odwrotną transkryptazę Superscript II (Life Technologies). CDNA z 10 ng RNA zastosowano do każdej PCR specyficznej dla cytokiny (21). W niektórych badaniach szybką amplifikację DNA przeprowadził LightCycler (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Niemcy), który jest szybkim termocyklerem z zastosowaniem barwnika specyficznego dla podwójnej nici SYBE Green I (22). Cykl reakcji PCR był następujący: początkowa denaturacja w 95 ° C przez 2 minuty, a następnie 45 cykli denaturacji w 95 ° C przez 0 sekund i połączone przedłużanie hybrydyzacji w 55 ° C przez 5 sekund i 72 ° C przez 10 sekund. Odczyty emisji fluorescencji cyklu do cyklu wykreślono na ekranie komputera w celu ciągłego monitorowania produktu PCR przy użyciu oprogramowania LightCycler. Wyniki przedstawiono jako fluorescencję przy 520 nm od 20 do 45 cykli reakcji PCR. Wewnątrzkomórkowy test cytokin. W celu analizy wewnątrzkomórkowej cytokiny, komórki jednojądrzaste wyizolowane ze śledziony, jelita cienkiego i grubego myszy SCID odtworzone za pomocą systemowo zagruntowanych komórek T GFP + CD4 + hodowano z kompletną pożywką RPMI zawierającą 10% FBS, 5. M 2ME, 10 U / ml penicyliny, 100. g / ml streptomycyny, rozpuszczalne mAb anty-CD28 (37,51, 2 .g / ml) i rmIL-2 (20 ng / ml) w 24-dołkowych płaskodennych płytkach powleczonych anty-CD3. mAb (145-2C11; 10 ug / ml) przez 16 godzin (23). GolgiStop (2 .M / ml, PharMingen) dodano podczas ostatnich czterech godzin inkubacji. Barwienie cytoplazmatyczne przeprowadzono za pomocą zestawu Cytofix / Cytoperm Kit (PharMingen). PE-skoniugowany anty-mysi IFN-y (XMG1.2), IL-4 (BUD4-1D11) i mAb anty-szczurzego IgG1 (R3-34) do kontroli izotypowej. Specyficzne komórki znakowane mAb analizowano w analizie metodą cytometrii przepływowej przy użyciu FACScalibur. Analiza danych. Dane wyrażono jako średnie. SE i oceniane za pomocą testu U Manna-Whitneya dla niesparowanych próbek przy użyciu programu statystycznego Statview II (SAS Inc., Cary, North Carolina, USA) zaprojektowanego dla komputera Macintosh. Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za statystycznie istotne. Wyniki Wielokrotne podawanie doustne z OVA powodowało ciężką biegunkę u myszy szczepionych systemowo. Aby wyjaśnić molekularne i komórkowe mechanizmy nadwrażliwości jelita, początkowo chcieliśmy ustalić model, który doprowadziłby myszy do rozwinięcia ciężkiego alergicznego objawu jelitowego, takiego jak biegunka. Aby wybrać najbardziej odpowiedni i niezawodny model, testowano grupy myszy BALB / c, C57BL / 6, SJL / J i C3H / HeJ. Spośród różnych szczepów myszy, stwierdziliśmy, że wielokrotne podawanie doustne myszom BALB / c dużej dawki OVA po wcześniejszej podskórnej immunizacji OVA w CFA spowodowało ciężką biegunkę (Figura 1a). Ponadto podobny wynik uzyskano u myszy SJL / J. Oksualną biegunkę zaobserwowano po ośmiu do dziesięciu doustnych podawaniach Ag u systemowo zagruntowanych myszy; jednakże wielokrotne doustne podawanie OVA bez układowego podawania pierwotnego nie wywoływało znaczących klinicznych objawów nadwrażliwości jelitowej. Biegunka była obserwowana w ciągu 30 minut do 2 godzin po ostatnim podaniu doustnym Ag i ulegała rozkładowi w ciągu 2 godzin, co sugeruje, że u tych myszy wystąpiły ostre reakcje alergiczne. Wyniki te wskazują, że rozwój biegunki był zależny od szczepów myszy. W związku z tym wybraliśmy myszy BALB / c do pozostałych badań. Rycina 1. Włączenie alergicznej biegunki za pośrednictwem Th2. Biegunkę indukowano u myszy szczepionych systemowo doustnie za pomocą 50 mg OVA (a, zamknięty okrąg). Myszy kontrolne poddano doustnej prowokacji 50 mg OVA bez jakiegokolwiek układowego szczepienia podstawowego (a, otwarte kółko). Eozynofile (b) i komórki tuczne (c, prawy panel) selektywnie infiltrowane do dużych jelita myszy indukowanych biegunką
[patrz też: osłabienie organizmu przyczyny, termometr microlife instrukcja obsługi, joanna derybowska ]
[podobne: 5lo bydgoszcz, hiperhomocysteinemia, artur puzio ]